Preconcentrazione su carta e isolamento di microvescicoli ed esosomi
Summary
Presentato è un protocollo per fabbricare un dispositivo cartaceo per l’arricchimento efficace e l’isolamento di microvescicoli ed esosomi.
Abstract
I microvescoli e gli esosomi sono piccole vesciche membranose rilasciate nell’ambiente extracellulare e circolate in tutto il corpo. Poiché contengono varie biomolecole derivate dalle cellule parentali come DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, il loro arricchimento e isolamento sono passaggi critici per il loro sfruttamento come potenziali biomarcatori per applicazioni cliniche. Tuttavia, i metodi di isolamento convenzionali (ad esempio, l’ultracentrifuga) causano perdite e danni significativi ai microvescicoli e agli esosomi. Questi metodi richiedono anche più passaggi ripetitivi di ultracentrifugazione, carico e sprechezza dei reagenti. Questo articolo descrive un metodo dettagliato per fabbricare un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) progettato per l’arricchimento efficace e l’isolamento di microvescicoli ed esosomi in modo semplice. Il design unico dell’Exo-PAD, costituito da strati multipiegati a fisarmonica con aree campione convergenti, è integrato con la tecnica di polarizzazione della concentrazione degli ioni, consentendo così l’arricchimento di cinque volte dei microvigli e degli esosomi su strati specifici. Inoltre, i microvescicoli arricchiti e gli esosomi sono isolati semplicemente dispiegando l’Exo-PAD.
Introduction
I microvescicoli e gli esosomi sono piccole vesciche a membrana che misurano rispettivamente 0,2 m e 30-200 nm. Essi sono secreti nell’ambiente extracellulare da diversi tipi di cellule1,2,3,4,5. Essi contengono informazioni sulle cellule parentali sotto forma di sottoinsiemi di DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, e circolano in tutto il corpo attraverso vari fluidi corporei come siero, plasma, urina, liquido cerebrospinale, liquido amniotico, e saliva6,7,8,9. Pertanto, le tecniche per un isolamento efficiente dei microviscoli e degli esosomi dai fluidi biologici possono fornire ampie opportunità nei campi della diagnosi, della prognosi e del monitoraggio in tempo reale della malattia, nonché nello sviluppo di nuove terapie.
Tuttavia, il metodo di isolamento convenzionale per microvicoli ed esosomi a base di ultracentrifugazione è estremamente dispendioso in termini di tempo e causa una significativa perdita e contaminazione del campione. Questo perché comporta diverse fasi ingombranti di pipettaggio e caricamento e lo scarto di vari reagenti con ultracentrifugazione ripetuta5,6,10,11,12.12 Inoltre, l’elevata sollecitazione di taglio indotta dall’ultracentrifugazione (100.000 x g)può causare il lisi fisico di microvessicoli ed esosomi, producendo bassi tassi di recupero (5-23%)6,13,14. Pertanto, è necessario sviluppare una tecnica di isolamento altamente efficiente e discreta per microvicoli ed esosomi per ridurre i danni e le perdite, ottenendo così tassi di recupero più elevati.
È stato sviluppato un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) per un isolamento più semplice, più delicato ed altamente efficiente di microvescicoli ed esosomi6. Il design dell’Exo-PAD è una carta multipiegata con aree campione collegate in serie che diminuiscono gradualmente di diametro. La tecnica di polarizzazione della concentrazione di ioni (ICP), che è un fenomeno nano-elettrocinetico che preconcentra le biomolecole cariche, è stata integrata con questo design unico. L’utilizzo dell’Exo-PAD ha portato a un arricchimento quintuplicato dei microvessicoli e degli esosomi in strati specifici e al loro isolamento semplicemente aprendo il dispositivo. In questo articolo viene descritto in dettaglio Exo-PAD, dalla fabbricazione e il funzionamento complessivo del dispositivo all’analisi del relativo utilizzo, per illustrare il metodo e mostrare risultati rappresentativi6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se l’Exo-PAD è stato utilizzato con successo per l’arricchimento e l’isolamento di microvicoli ed esosomi, diversi punti critici devono essere attentamente considerati: 1) il tempo di incubazione del forno e la temperatura durante la preparazione del dispositivo, 2) tempo di elaborazione, 3) applicazione di tensione con diversi numeri di strato e diametri di area campione, e 4) l’applicabilità ai campioni clinici.
Il tempo di incubazione e la temperatura indicati nel protocollo sono co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee è stato sostenuto da una borsa di ricerca della Kwangwoon University nel 2019. Hyerin Kim è stata sostenuta dal “Programma di sviluppo delle competenze per gli specialisti dell’industria” del Ministero coreano del commercio, dell’industria e dell’energia (MOTIE), gestito dal Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (n. P0002397, programma HRD per la convergenza industriale di dispositivi intelligenti indossabili).
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
References
- Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
- Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes – vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
- Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
- Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
- Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
- Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
- Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
- Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175 (2018).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
- Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).
