Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen
Summary
Präsentiert wird ein Protokoll zur Herstellung eines papierbasierten Geräts zur effektiven Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen.
Abstract
Mikrovesikeln und Exosomen sind kleine membranöse Vesikel, die in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt und im ganzen Körper zirkuliert. Da sie verschiedene elterzellabgeleitete Biomoleküle wie DNA, mRNA, miRNA, Proteine und Lipide enthalten, sind ihre Anreicherung und Isolierung entscheidende Schritte für ihre Ausnutzung als potenzielle Biomarker für klinische Anwendungen. Herkömmliche Isolationsmethoden (z. B. Ultrazentrifugation) verursachen jedoch signifikante Verluste und Schäden an Mikrovesikeln und Exosomen. Diese Methoden erfordern auch mehrere sich wiederholende Schritte der Ultrazentrifugation, Desagung und Verschwendung von Reagenzien. Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung eines Origami-Papier-basierten Geräts (Exo-PAD), das für die effektive Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen auf einfache Weise entwickelt wurde. Das einzigartige Design des Exo-PAD, bestehend aus akkordeonartigen mehrfaltigen Schichten mit konvergenten Probenbereichen, ist in die Ionenkonzentrationspolarisationstechnik integriert und ermöglicht so eine fünffache Anreicherung der Mikrovesiken und Exosomen auf bestimmte Schichten. Darüber hinaus werden die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen durch einfaches Entfalten des Exo-PAD isoliert.
Introduction
Mikrovesikeln und Exosomen sind kleine Membranbläschen mit einer Größe von 0,2 x 1 m bzw. 30 bis 200 nm. Sie werden von mehreren verschiedenen Zelltypen1,2,3,4,5in die extrazelluläre Umgebung sezerniert. Sie enthalten elterliche Zellinformationen in Form von Teilmengen von DNA, mRNA, miRNA, Proteinen und Lipiden und zirkulieren im ganzen Körper über verschiedene Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Fruchtwasser und Speichel6,7,8,9. So können Techniken zur effizienten Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen aus biologischen Flüssigkeiten umfangreiche Möglichkeiten in den Bereichen Diagnose, Prognose und Echtzeitüberwachung von Krankheiten sowie bei der Entwicklung neuer Therapeutika bieten.
Die herkömmliche Isolationsmethode für Mikrovesikeln und Exosomen auf Basis der Ultrazentrifugation ist jedoch extrem zeitaufwändig und verursacht einen erheblichen Verlust und eine Kontamination der Probe. Dies liegt daran, es beinhaltet mehrere umständliche Pipettier- und Ladeschritte und das Wegwerfen verschiedener Reagenzien mit wiederholter Ultrazentrifugation5,6,10,11,12. Darüber hinaus kann die hohe Scherspannung, die durch Ultrazentrifugation induziert wird (100.000 x g), die physikalische Lyse von Mikrovesikeln und Exosomen verursachen und zu schlechten Rückgewinnungsraten (5-23%)6,13,14führen. Daher muss eine hocheffiziente, unauffällige Isolationstechnik für Mikrovesikeln und Exosomen entwickelt werden, um Schäden und Verluste zu reduzieren und so höhere Rückgewinnungsraten zu erzielen.
Ein Origami-Papier-basiertes Gerät (Exo-PAD) wurde für eine einfachere, schonendere und hocheffiziente Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen6entwickelt. Das Design des Exo-PAD ist ein mehrfaches Papier mit seriell verbundenen Probenbereichen, die allmählich im Durchmesser abnehmen. Die Ionkonzentrationspolarisationstechnik (ICP), ein nano-elektrokinetisches Phänomen, das geladene Biomoleküle vorkonzentriert, wurde in dieses einzigartige Design integriert. Der Einsatz des Exo-PAD führte zu einer fünffachen Anreicherung der Mikrovesikeln und Exosomen in bestimmten Schichten und deren Isolierung durch einfaches Entfalten des Geräts. Dieser Artikel beschreibt die Exo-PAD im Detail, von der gesamten Gerätefertigung und -bedienung bis zur Analyse ihrer Verwendung, um die Methode zu veranschaulichen und repräsentative Ergebnisse zu zeigen6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl der Exo-PAD erfolgreich zur Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen eingesetzt wurde, sollten mehrere kritische Punkte sorgfältig berücksichtigt werden: 1) die Inkubationszeit und -temperatur des Ofens während der Gerätevorbereitung, 2) Verarbeitungszeit, 3) Anwendung von Spannung mit unterschiedlichen Schichtzahlen und Probenflächendurchmessern und 4) Anwendbarkeit auf klinische Proben.
Die im Protokoll angegebene Inkubationszeit und -temperatur sind optimierte …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444 unterstützt. J. H. Lee wurde 2019 durch ein Forschungsstipendium der Kwangwoon University unterstützt. Hyerin Kim wurde vom “Competency Development Program for Industry Specialists” des koreanischen Ministeriums für Handel, Industrie und Energie (MOTIE) unterstützt, das vom Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-Programm zur industriellen Konvergenz tragbarer Intelligenter Geräte).
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
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