Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen
Summary
Gepresenteerd is een protocol om een op papier gebaseerd apparaat te fabriceren voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen.
Abstract
Microvesicles en exosomen zijn kleine membranous vesicles vrijgegeven aan de extracellulaire omgeving en verspreid door het hele lichaam. Omdat ze verschillende door ouderlijke cellen afgeleide biomoleculen bevatten, zoals DNA, mRNA, miRNA, eiwitten en lipiden, zijn hun verrijking en isolatie cruciale stappen voor hun exploitatie als potentiële biomarkers voor klinische toepassingen. Conventionele isolatiemethoden (bijvoorbeeld ultracentrifugatie) veroorzaken echter aanzienlijk verlies en schade aan microvesicles en exosomen. Deze methoden vereisen ook meerdere repetitieve stappen van ultracentrifugatie, laden en verspillen van reagentia. Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode om een op origamipapier gebaseerd apparaat (Exo-PAD) te fabriceren dat is ontworpen voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen op een eenvoudige manier. Het unieke ontwerp van de Exo-PAD, bestaande uit accordeonachtige multifolded lagen met convergente monstergebieden, is geïntegreerd met de ionconcentratiepolarisatietechniek, waardoor de microvesicles en exosomen op specifieke lagen vervijfvoudigd kunnen worden. Bovendien worden de verrijkte microvesicles en exosomen geïsoleerd door simpelweg de Exo-PAD uit te vouwen.
Introduction
Microvesicles en exosomen zijn kleine membraanvezelpen van respectievelijk 0,2−1 μm en 30−200 nm. Ze worden afgescheiden in de extracellulaire omgeving door verschillende celtypen1,2,3,4,5. Ze bevatten ouderlijke cel informatie in de vorm van subsets van DNA, mRNA, miRNA, eiwitten, en lipiden, en circuleren door het hele lichaam via verschillende lichaamsvloeistoffen zoals serum, plasma, urine, hersenvocht, vruchtwater, en speeksel6,7,8,9. Zo kunnen technieken voor een efficiënte isolatie van microvesicles en exosomen van biologische vloeistoffen uitgebreide mogelijkheden bieden op het gebied van de diagnose, prognose en real-time monitoring van de ziekte, evenals in de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
De conventionele isolatiemethode voor microvesicles en exosomen op basis van ultracentrifugatie is echter uiterst tijdrovend en veroorzaakt aanzienlijk verlies en verontreiniging van het monster. Dit komt omdat het gaat om verschillende omslachtige pipetting en laadstappen en het weggooien van verschillende reagentia met herhaalde ultracentrifugatie5,6,10,11,12. Bovendien kan de hoge afschuifspanning veroorzaakt door ultracentrifugatie (~100.000 x g) de fysieke lyse van microvesicles en exosomen veroorzaken , wat een slechte herstelsnelheid oplevert (5−23%)6,13,14. Daarom moet een zeer efficiënte, onopvallende isolatietechniek voor microvesicles en exosomen worden ontwikkeld om schade en verlies te verminderen, waardoor hogere herstelsnelheden worden bereikt.
Een op origami-papier gebaseerd apparaat (Exo-PAD) is ontwikkeld voor een eenvoudigere, zachtere en zeer efficiënte isolatie van microvesicles en exosomen6. Het ontwerp van de Exo-PAD is een meervoudig papier met serieel verbonden monstergebieden die geleidelijk in diameter afnemen. De ionconcentratiepolarisatie (ICP) techniek, een nano-elektro-elektro-elektrokinetisch fenomeen dat geladen biomoleculen preconcentraeert, werd geïntegreerd met dit unieke ontwerp. Het gebruik van de Exo-PAD resulteerde in een vijfvoudige verrijking van de microvesicles en exosomen in specifieke lagen en hun isolatie door simpelweg het apparaat te ontvouwen. Dit artikel beschrijft de Exo-PAD in detail, van de algehele fabricage en werking van het apparaat tot de analyse van het gebruik ervan, om de methode te illustreren en representatieve resultaten weer te geven6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel de Exo-PAD met succes werd gebruikt voor de verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen, moeten verschillende kritieke punten zorgvuldig worden overwogen: 1) de incubatietijd en temperatuur van de oven tijdens de bereiding van het apparaat, 2) verwerkingstijd, 3) toepassing van spanning met verschillende laagnummers en diameters van het monstergebied, en 4) toepasselijkheid op klinische monsters.
De incubatietijd en temperatuur in het protocol zijn geoptimaliseerde omstandighed…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444. J. H. Lee werd in 2019 ondersteund door een onderzoeksbeurs van de Universiteit van Kwangwoon. Hyerin Kim werd ondersteund door het “Competency Development Program for Industry Specialists” van het Koreaanse ministerie van Handel, Industrie en Energie (MOTIE), beheerd door het Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (nr. P0002397, HRD programma voor industriële convergentie van draagbare slimme apparaten).
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
References
- Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
- Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes – vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
- Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
- Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
- Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
- Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
- Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
- Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175 (2018).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
- Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).
