Комбинированная анатомическая и функциональная трассировка in vivo вентральных тегментальных клемм глутамата в гиппокампе
Summary
Текущий протокол демонстрирует простой метод отслеживания проекций глутамата вентральной тегментальной области (VTA) к гиппокампу. Фотостимуляция нейронов глутамата VTA была объединена с записью CA1, чтобы продемонстрировать, как клеммы глутамата VTA модулируют предполагаемое пирамидальное время срабатывания CA1 in vivo.
Abstract
Оптогенетическая модуляция субпопуляций нейронов в мозге позволила исследователям препарировать нейронные цепи in vivo и ex vivo. Это дает предпосылку для определения роли типов нейронов в нейронной цепи и их значения в кодировании информации по отношению к обучению. Аналогичным образом, метод может быть использован для проверки физиологического значения двух или более связанных областей мозга у бодрствующих и анестезируемых животных. Текущее исследование демонстрирует, как нейроны глутамата VTA модулируют скорость срабатывания мистических пирамидальных нейронов в CA1 (гиппокампе) анестезированных мышей. Этот протокол использует аденоассиоциированную вирусную (AAV)-зависимую маркировку нейронов глутамата VTA для отслеживания пресинаптических клемм Глутамата VTA в слоях гиппокампа. Экспрессия контролируемого светом опсина (канальногородопсина; hChR2) и флуоресцентного белка (eYFP), затаенный вектором AAV, позволяла антероградную трассировку клемм Глутамата VTA и фотостимуляцию тел клеток глутамата VTA (в VTA). Высокоимпедантные острые кремниевые электроды были размещены в CA1 для обнаружения многоблестровых и одноблестровых реакций на фотостимуляцию VTA in vivo. Результаты этого исследования демонстрируют слоисто-зависимое распределение пресинаптических терминалей Глутамата VTA в гиппокампе (CA1, CA3 и DG). Кроме того, фотостимуляция нейронов глутамата VTA увеличивала скорость срабатывания и разрыва предполагаемой пирамидальной единицы CA1 in vivo.
Introduction
В последнее десятилетие был разработан массив генетических инструментов для повышения специфичности модуляции нейронного типа и картирования сложных нейронных сетей1. Примечательно, что нейротропные вирусы с присущей им способностью заражать и реплицироваться в нейронных клетках были развернуты для экспрессии или абляции специфических белков в подполах нейронов. При получении флуоресцентных белков или генетически закодированных индикаторов синаптической активности трансфекция векторов AAV маркируют и очерчают нейронные сети по областям мозга2,3. Выбор промотора в конструкции AAV направляет экспрессию вектора в типах нейронов с некоторым уровнем специфичности(промотор-зависимая экспрессия). Однако благодаря рекомбинации Cre-lox конструкции AAV развертываются с большей специфичностью для маркировки нейронов4,5,6,7. Следует отметить, что фотоактивированные микробные опсины и флуоресцентные белки, упакованные в векторы AAV, могут быть экспрессированы в различных подтипах нейронов8и идеально подходят для визуализации, трассировки цепей нейронного типа и фотомодуляции9,10.
AAVs конструирует стереотаксически введенные в область мозга (или ядро), управляет экспрессией репортерного белка в терминалах сомы, дендрита и аксонов. Нейронная экспрессия AAV с репортерным геном (eYFP) облегчает маркировку тел нейронных клеток и анатомическую трассировку проекций в и из других областей мозга11,12,13,14. Конструкции AAV-eYFP, несущие управляемый светом опсин (например, hChR2), могут быть развернуты в качестве инструмента для визуализации6,15 и физиологического отслеживания нейронных проекций на целевые области мозга in vivo16. В зависимости от серотипа AAV направление маркировки нейронов может быть антероградным или ретроградным11,12. Предыдущие исследования установили, что AAV5 путешествует антероградно в нейронах12. Таким образом, фотостимуляция клеточных тел, экспрессирующих hChR2, производит пресинаптические эффекты в других частях мозга(мишень) 17.
Здесь AAV (серотип 5) с промотором CaMKIIα использовался для экспрессии eYFP (репортер) и hChR2 (опсин) в нейронах глутамата VTA и аксональных проекциях. Результаты этого исследования демонстрируют слоисто-зависимое распределение пресинаптических терминалей VTA-глутамата в областях гиппокампа CA1, CA3 и DG. Кроме того, фотостимуляция нейронов глутамата VTA увеличивала скорость срабатывания CA1 in vivo по сравнению с базовыми значениями. Этот протокол использует доступные инструменты и коммерчески доступное программное обеспечение, которое может повысить качество данных, полученных в результате экспериментов по отслеживанию нейронных цепей.
Protocol
Representative Results
Discussion
За последнее десятилетие проектирование конструкций AAV значительно продвинулось вперед. Таким образом, более нейрон-специфические промоторы были включены в массив серотипов AAV для улучшения специфичности трансфекции14. Комбинируя гены флуоресцентных белков, транспортер?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансируется грантом CBS Bridging Grant, присужденным OOM. OOM, PAA и AS разработали исследование и провели эксперименты. AS и PAA проанализировали результаты. OOM и PAA подготовили рукопись. Мы благодарим д-ра Карла Диссерота (Стэнфордский университет) за то, что он сделал AAV доступным для нашего использования.
Materials
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | |||
| Intan Recording Controller | |||
| Neuroexplorer | |||
| Plexon Offline Spike Sorter | |||
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
- Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
- Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
- Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
- Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
- Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
- Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
- Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
- Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
- Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
- Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
- Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
- Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
- Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
- Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
- McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
- McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
