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Neuroscience

Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61282
, ,
1Department of Comparative Biomedical Sciences,Louisiana State University School of Veterinary Medicine

Summary

Das aktuelle Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Rückverfolgung von ventralen Tegmentalflächen (VTA) Glutamatprojektionen auf den Hippocampus. Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen wurde mit CA1-Aufnahmen kombiniert, um zu zeigen, wie VTA-Glutamat-Terminals die mutmaßliche pyramidale CA1-Feuerrate in vivo modulieren.

Abstract

Die optogenetische Modulation von Neuronensubpopulationen im Gehirn hat es Forschern ermöglicht, neuronale Schaltkreise in vivo und ex vivo zu sezieren. Dies bietet eine Voraussetzung für die Bestimmung der Rolle von Neuronentypen innerhalb eines neuronalen Schaltkreises und ihrer Bedeutung für die Informationscodierung in Bezug auf das Lernen. Ebenso kann die Methode verwendet werden, um die physiologische Bedeutung von zwei oder mehr miteinander verbundenen Hirnregionen bei wachen und betäubten Tieren zu testen. Die aktuelle Studie zeigt, wie VTA-Glutamat-Neuronen die Feuerrate von mutmaßlichen Pyramidenneuronen im CA1 (Hippocampus) anästhesierter Mäuse modulieren. Dieses Protokoll verwendet adeno-assoziierte Virus (AAV)-abhängige Markierung von VTA-Glutamat-Neuronen für die Rückverfolgung von VTA-präsynaptischen Glutamat-Terminals in den Schichten des Hippocampus. Die Expression von lichtgesteuertem Opsin (Channelrhodopsin; hChR2) und Fluoreszenzprotein (eYFP), die durch den AAV-Vektor beherbergt werden, ermöglichte die anterograde Rückverfolgung von VTA-Glutamatterminals und die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronenzellkörpern (im VTA). Hochimige akute Siliziumelektroden wurden im CA1 positioniert, um Reaktionen von mehreren einheiten und einzelnen Einheiten auf VTA-Photostimulation in vivo zu erkennen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die schichtabhängige Verteilung von präsynaptischen VTA-Glutamatterminals im Hippocampus (CA1, CA3 und DG). Auch die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen erhöhte die Feuer- und Burst-Rate von mutmaßlichen CA1-Pyramideneinheiten in vivo.

Introduction

In den letzten zehn Jahren wurde eine Reihe genetischer Werkzeuge entwickelt, um die Spezifität der Modulation vom Neuronentyp und die Kartierung komplexer neuronaler Netze zu erhöhen1. Insbesondere neurotrope Viren mit einer inhärenten Fähigkeit, sich in neuronalen Zellen zu infizieren und zu replizieren, wurden eingesetzt, um bestimmte Proteine in Neuronensubtypen zu exprimieren oder abtränken. Bei der Unterung von Fluoreszenzproteinen oder genetisch kodierten synaptischen Aktivitätsindikatoren kennzeichnen und beschreiben transfizierte AAV-Vektoren neuronale Netzwerke über Gehirnregionen hinweg2,3. Die Wahl eines Promotors im AAV-Konstrukt steuert die Expression des Vektors in Neuronentypen mit einem gewissen Grad an Spezifität(promotorabhängige Expression). Durch die Cre-lox-Rekombination werden AAV-Konstrukte jedoch mit größerer Spezifität für die Neuronenmarkierung4,5,6,7eingesetzt. Bemerkenswert ist, dass photoaktivierte mikrobielle Opsine und Fluoreszenzproteine, die in AAV-Vektoren verpackt sind, in verschiedenen Neuronensubtypen8exprimiert werden können und ideal für die Bildgebung, die Verfolgung von Neuronenschaltungen und die Photomodulation9,10sind.

AAVs-Konstrukte, die stereotaktisch in eine Gehirnregion (oder einen Zellkern) injiziert werden, treiben die Expression des Reporterproteins in den Terminals soma, Dendriten und Axone an. Die neuronale Expression von AAV, die ein Reportergen (eYFP) beherbergt, erleichtert die Markierung von Neuronenzellkörpern und die anatomische Verfolgung von Projektionen zu und von anderen Gehirnregionen11,12,13,14. AAV-eYFP-Konstrukte, die lichtgesteuertes Opsin (z. B. hChR2) tragen, können als Werkzeug für die Bildgebungvon 6,15 und die stimulationsbasierte physiologische Verfolgung neuronaler Projektionen auf Hirnareale in vivo16eingesetzt werden. Abhängig vom AAV-Serotyp kann die Richtung der Neuronenmarkierung anterograde oder retrograd sein11,12. Frühere Studien haben ergeben, dass AAV5 anterograde in Neuronenreist 12. So erzeugt die Photostimulation von Zellkörpern, die hChR2 exprimieren, präsynaptische Effekte an anderer Stelle im Gehirn (Ziel)17.

Hier wurde AAV (Serotyp 5) mit einem CaMKIIα-Promotor verwendet, um eYFP (Reporter) und hChR2 (Opsin) in VTA-Glutamat-Neuronen und axonalen Projektionen zu exprimieren. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die schichtabhängige Verteilung von VTA-Glutamat-präsynaptischen Terminals in den Hippocampusregionen CA1, CA3 und DG. Auch die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen erhöhte die CA1-Feuerraten mit mehreren Einheiten und Einzeleinheiten in vivo im Vergleich zu den Ausgangswerten. Dieses Protokoll verwendet erschwingliche Tools und kommerziell erhältliche Software, die die Qualität der Daten aus neuronalen Schaltkreis-Tracing-Experimenten erhöhen können.

Protocol

Alle experimentellen und Tierhandhabungsverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Louisiana State University School of Veterinary Medicine genehmigt. 1. Versuchstier Verwenden Sie 5-6 Wochen alte Mäuse. Haus 3-5 Tiere pro Käfig unter Standardbedingungen von 12 h abwechselnd Hell-Dunkel-Zyklus. Nahrung und Wasser sollten ad libitum zur Verfügung gestellt werden. 2. Kraniotomie und tierische Zubereitung…

Representative Results

Anterograde Rückverfolgung Die AAV-Expression wurde durch Immunfluoreszenz-Bildgebung des Reporterproteins (eYFP) im VTA von C57BL/6-Mäusen 21 Tage nach der Injektion verifiziert(Abbildung 2). Die erfolgreiche anterograde Markierung von präsynaptischen VTA-Glutamatprojektionen im Hippocampus wurde auch durch eYFP-Nachweis in den Schichten von DG, CA3 und CA1 nachgewiesen(Abbildung 6a–d; Film 2 und 3</stro…

Discussion

In den letzten zehn Jahren hat sich das Design von AAV-Konstrukten erheblich weiterentwickelt. Daher wurden mehr neuronenspezifische Promotoren in eine Reihe von AAV-Serotypen integriert, um die Transfektionsspezifität zu verbessern14. Durch die Kombination von Genen für Fluoreszenzproteine, Transporter, Rezeptoren und Ionenkanäle existieren nun Bibliotheken von AAV für bildgebung, neuromodulation und synaptische Aktivitätserkennung. In kommerziell erhältlichen AAV-Konstrukten ermöglicht ei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird durch den CBS Bridging Grant finanziert, der ooM verliehen wird. OOM, PAA und AS entwarfen die Studie und führten die Experimente durch. AS und PAA analysierten die Ergebnisse. OOM und PAA bereiteten das Manuskript vor. Wir danken Dr. Karl Disseroth (Stanford University) für die Bereitstellung des AAV für unsere Nutzung.

Materials

3% Hydrogen peroxide Fisher chemical H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP Addgene Plasmid #26969
BNC cable Amazon
BNC Splitter Amazon
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. Thorlabs ADAL1-5
Drill Dremel LR 39098
Gelatin coated slides Fisher scientific OBSLD01CS
Hamilton's syringe (Neuros) WPI Inc. 06H
Head stage adapter Neuronexus Adpt-Q4-OM32
High impedance silicon probe Neuronexus Q1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording Controller INTAN RHD2000
Iodine solution Dynarex 1425
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Ketamine Spectrum K1068
LED Driver Thorlabs LEDD1B
LED light source (470 nm)-blue light Thorlabs M470F3
Micromanipulator Narishige M0-203
Optic fiber Thorlabs CFMLC14L05
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) Amazon M0.6 X 2mm
Pre-amplifier headstage (32 Channel) INTAN C3314
Stereotaxic frame Kopf 1530
TTL pulser Prizmatix 4031
Urethane Sigma U2500
Xylazine Alfa Aesar J61430
Software Company Version
Graphpad Prism
Intan Recording Controller
Neuroexplorer
Plexon Offline Spike Sorter
ACSF Composition:
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).
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References

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Shrestha, A., Adeniyi, P. A., Ogundele, O. M. Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus. J. Vis. Exp. (163), e61282, doi:10.3791/61282 (2020).
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