تبسيط أخذ العينات وزراعة اليرقات العالمية الأوقيانوسية، أوكوبيورا دييكا
Summary
Oikopleura dioica هو كائن حي نموذجي في مختلف مجالات البيولوجيا. نحن نصف أساليب أخذ العينات، وتحديد الأنواع، وإعداد زراعة، وبروتوكولات زراعة للحيوانات وعلف الطحالب. ونسلط الضوء على العوامل الرئيسية التي ساعدت على تعزيز النظام الثقافي ومناقشة المشاكل والقرارات المحتملة.
Abstract
Oikopleura dioica هو chordate planktonic مع قدرة استثنائية للتغذية الفلتر ، وقت التوليد السريع ، والتنمية المبكرة المحفوظة ، وميينوم مدمج. ولهذه الأسباب، يعتبر كائناً نموذجياً مفيداً للدراسات الإيكولوجية البحرية، والبيولوجيا التطورية، وعلم الجينوم. وبما أن البحوث تتطلب في كثير من الأحيان إمدادات ثابتة من الموارد الحيوانية، فمن المفيد إنشاء نظام ثقافة موثوق به ومنخفض الصيانة. هنا نحن وصف طريقة خطوة بخطوة لإنشاء ثقافة O. دييكا. ونصف كيفية اختيار مواقع المعاينة المحتملة، وطرق جمعها، وتحديد هوية الحيوانات المستهدفة، وإعداد نظام الاستزراع. نحن نقدم المشورة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها بناءً على تجاربنا الخاصة. كما نسلط الضوء على العوامل الحاسمة التي تساعد على الحفاظ على نظام ثقافة قوي. على الرغم من أن بروتوكول الثقافة المقدمة هنا هو الأمثل ل O. dioica، ونأمل لدينا تقنية أخذ العينات والإعداد الثقافة سوف تلهم أفكارا جديدة للحفاظ على اللافقاريات البحرية الهشة الأخرى.
Introduction
وقد كانت الكائنات الحية النموذجية مفيدة في معالجة العديد من المسائل البيولوجية بما في ذلك تلك المتعلقة بالتنمية، وعلم الوراثة، وعلم وظائف الأعضاء. وعلاوة على ذلك، فإن الكائنات العضوية النموذجية الإضافية تسهل اكتشافات جديدة، وبالتالي فهي حاسمة لتحقيق فهم أكبر للطبيعة1،2. العوالق الحيوانية البحرية هي مجموعات متنوعة من الكائنات الحية التي تلعب دورا هاما في النظم الإيكولوجية للمحيطات3،4،5،6. على الرغم من وفرة وأهميتها الإيكولوجية، والكائنات الجيلاتية مثل tunicates planktonic غالبا ما تكون ممثلة تمثيلا ناقصا في دراسات التنوع البيولوجي العوالق لأن شفافيتها وهشاشتها جعل جمع الحقل وتحديد التحدي7،8. تقنيات أخذ العينات وتكييفها و الزراعة المختبرية تسمح لمراقبة أوثق من الحيوانات في المختبر، والتي زادت المعرفة في بيولوجيا planktonic tunicates9،10،11،12.
اليرقات (Appendicularians) هي فئة من التونيكات البحرية السباحة الحرة التي تضم حوالي 70 نوعا وصفت في جميع أنحاء العالم8،13. كما أنها واحدة من المجموعات الأكثر وفرة داخل المجتمعات العوالق الحيوانية14,15,16,17, تمثل اليرقات مصدر الغذاء الأساسي للكائنات الكبيرة العوالق مثل يرقات الأسماك18,19. على عكس ascidians-الريسيل tunicates-larvaceans الاحتفاظ مورفولوجيا مثل الشرغوف وتبقى planktonic طوال حياتهم20. يعيش كل داخل بنية تغذية مرشحية معقدة مبنية ذاتياً تعرف باسم المنزل. يتراكمون الجسيمات في بيوتهم عن طريق خلق تيارات المياه من خلال حركة متموجة من ذيولها21. يتم التخلص من المنازل المسدودة على مدار اليوم ، وبعضها يشكل مجاميع الكربون والمصارف في نهاية المطاف إلى قاع البحر22؛ وهكذا، تلعب اليرقات دوراً رئيسياً في تدفق الكربون العالمي23. وتفيد التقارير بأن معظم الأنواع تعيش في المنطقة البحرية الواقعة في حدود 100 متر من عمود الماء13؛ ومع ذلك، من المعروف أن اليرقات العملاقة Bathochordaeus أن يسكن أعماق 300 م24. وكشفت دراسة أجريت على باثوتشورديوس في خليج مونتيري، كاليفورنيا أن الحيوانات هي أيضا بمثابة ناقل بيولوجي للبلاستيك الدقيق، مما يشير إلى أهمية محتملة في فهم دور الزوائد في النقل الرأسي وتوزيع البلاستيك الدقيق في المحيطات25.
Oikopleura دييكا، وهو نوع من اليرقات ، وقد اجتذب الانتباه في السنوات الأخيرة ككائن حي نموذجي بسبب العديد من الخصائص الرائعة. ويشيع الإبلاغ عنه في جميع أنحاء محيطات العالم. هو خصوصا وافرة في المياه الساحلية26، والذي يسمح أخذ العينات سهلة من الشاطئ. على المدى الطويل، و الاستزراع مستقرة هو ممكن مع كل من مياه البحر الطبيعية والاصطناعية27،28،29. أوقات توليد درجة الحرارة تعتمد قصيرة مثل 4-9 أيام في ظروف المختبر. لديها براز عالية مع كل أنثى قادرة على إنتاج > 300 بيضة على مدار السنة. كما سترة، فإنه يحتل موضعاً مهمًا فيلوجينتيك لفهم تطور chordate30،31. في 70 ميغابايت، O. دييكا لديه أصغر الجينوم المحدد بين جميع chordates32. بين اليرقات، O. دييكا هو الأنواع غير الموصوفة فقط غير هيرامبورديتيك حتى الآن33.
أول نجاح O. dioica الثقافة مع المختبر نمت الطحالب الدقيقة وذكرت Paffenhöfer34. تم تطوير بروتوكول الثقافة الأصلي باستخدام المحركات والمجاذيف المتزامنة من قبل فينو وغورسكي35 واعتمدته في وقت لاحق من قبل مختبرات متعددة. وفي الآونة الأخيرة، أبلغ “فوجيوآخرون” (Fujii et al. 36) عن زراعة أو ديوكا في مياه البحر الاصطناعية، ونظام ثقافة قوي ومجموعة ميدانية وصفها بوكيه وآخرون27، وأبلغ مارتي-سولانس وآخرون29عن بروتوكول أمثل لنظام مبسط ومعقول التكلفة. وبصرف النظر عن النظام الثقافي التقليدي Oikopleura، تصميم ذكرت حديثا مع خزان تربية أنبوب مزدوج لديه أيضا القدرة على ثقافة Oikopleura sp. 37–
نقدم بروتوكول مفصل لبدء O. dioica أحادية الثقافة على أساس مجموعة من البروتوكولات التي وضعتها مجموعات البحوث الرئيسية Oikopleura في المركز الدولي للسارس للبيولوجيا الجزيئية البحرية27، جامعة برشلونة29، جامعة أوساكا28، وملاحظاتنا الخاصة. في بروتوكولات الثقافة المنشورة سابقا، تم وصف المعلومات التفصيلية المتعلقة بتكوين وسائل الإعلام الطحالب، وتقنيات أخذ العينات الشاطئية، وتحديد أوكبلورا تقريبا فقط، مما ترك الكثير من الغموض. هنا، مع مساعدة المعلومات المرئية في بروتوكول الفيديو، قمنا بتجميع جميع المعلومات الهامة اللازمة لإنشاء ثقافة أو دييكا من الألف إلى إلى المدى الأعلى بطريقة مباشرة، خطوة بخطوة. نحن وصف كيفية التمييز O. دييكا من الأنواع الأخرى التي يشيع ذكرها, O. longicauda, التي هي واحدة من الخطوات الأكثر تحديا. على الرغم من أن النظم الثقافية الحالية قابلة للتطبيق لزراعة O. dioica في جميع أنحاء العالم، فإننا نسلط الضوء على أهمية تعديل البروتوكول على أساس الظروف البيئية المحلية. وتجمع المعلومات المقدمة بين البيانات المنشورة على نطاق واسع، فضلا عن المعارف المكتسبة من خلال الخبرة. البروتوكول الحالي مناسب بشكل مثالي للباحثين المهتمين بتأسيس ثقافة من الصفر.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتسهيل المرونة في تأسيس ثقافة O. دييكا، من المهم فهم الموائل الطبيعية للحيوانات. توفر البيانات الموسمية معلومات حول نطاقات المعلمات الفيزيائية، والتي يمكن استخدامها لتوجيه ظروف الزراعة المختبرية. كما أنه يساعد في فهم التقلبات الموسمية في وفرة الحيوانات. في أوكيناوا، تم العثور على أكثر موثوقية من يونيو إلى أكتوبر. ومع ذلك ، في خليج طوكيو ، يبلغ عدد السكان ذروته في فبراير و41أكتوبر . على الرغم من أن زراعة O. dioica غالبا ما يقال في 20 درجة مئوية أو أقل27,28,29, أوكيناوا O. dioica يظهر أفضل البقاء على قيد الحياة في درجات حرارة فوق 20 °C;. ويمكن تفسير ذلك من حقيقة أن درجة حرارة مياه البحر السطحية الدنيا في أوكيناوا هي 20 درجة مئوية(الشكل 6). قد تتأثر وفرة O. ديويكا أيضا من قبل تزهر العوالق النباتية42 و وفرة المفترس43,44. بغض النظر عن المكان الذي يتم فيه جمع O. dioica ، فإن فهم موسمية السكان المحليين يزيد من فرصة أخذ العينات ونجاح الاستزراع.
ونظرا للموسم المناسب والموقع، صافي أخذ العينات هو وسيلة فعالة لجمع أعداد كبيرة من Oikopleura مع الحد الأدنى من الجهد. ويمكن أيضا استخدام الشباك ذات الألواح ذات حجم الشبكة الأصغر (60-70 ميكرومتر) لجمع جميع مراحل الحيوانات. ونادرا ما توجد الحيوانات الناضجة تماما في الشبكة، وربما بسبب هشاشتها في نهاية دورة الحياة. ولذلك، يتم تحقيق تحديد الأنواع تليها أخذ العينات عن طريق المراقبة المجهرية للخلايا دون الحمراء. عادة ما يظهر الأفراد الناضجون بعد يوم أو يومين من أخذ العينات مع استمرار نمو الحيوانات في المختبر. وعلى الرغم من أن أخذ العينات الصافية يتسم بالكفاءة، فقد يكون من الضروري اتباع أساليب بديلة لأخذ العينات في ظروف مختلفة. على سبيل المثال، يمكن أخذ العينات الصافية بالقرب من المناطق الحضرية جمع أعداد كبيرة من العوالق النباتية، مما يجعل من الصعب عزل أوكوبلو مورا. في مثل هذه الحالات، يوصى بأخذ عينات بسيطة من الجرافة لجمع مياه البحر السطحية أو أخذ عينات من القوارب من مناطق خارج الميناء. وأظهرت النتائج أن التغير التدريجي في الملوحة بسبب أيام المطر المتتالية لم يؤثر على وفرة أو دييكا. ومع ذلك، ينبغي تجنب أخذ عينات الشاطئ مباشرة بعد الظواهر الجوية المتطرفة مثل الأعاصير المدارية. هذه الأحداث تسبب تغييرات كيميائية حيوية مفاجئة وجذرية في الجسم المحمي من الماء45,46. قد تحمل جريان مياه الأمطار الملوثات والرواسب والمواد المغذية الزائدة، والتي تزيد من العكر وانخفاض نوعية المياه47. قد تكون العوالق المغذية للتصفية، مثل Oikopleura،عرضة بشكل خاص لهذه التغييرات بسبب طريقة التغذية ومحدودية الحركة. في مثل هذه الظروف، نوصي بتأجيل أخذ العينات لبضعة أيام حتى تعود الظروف المحلية إلى طبيعتها.
إدخال نظام تصفية متعدد الخطوات أمر ضروري للحفاظ على الكائنات الصغيرة، والكائنات المغذية للتصفية مثل O. dioica. وباستخدام مياه البحر التي تمت تصفيتها بشكل سيئ (على سبيل المثال، شبكة 25 ميكرومتر في نظام الثقافة السابق)، كانت الثقافة غير مستقرة في كثير من الأحيان خاصة خلال فصل الصيف، مما قد يرجع إلى ارتفاع وفرة العوالق النباتية. على الرغم من أن بعض العوالق النباتية مفيدة لنمو O. ديويكا، والبعض الآخر إنتاج السموم البيومين التي يمكن أن تسبب تطورا غير طبيعي من أجنة O. ديويكا 48. وبالإضافة إلى ذلك، تركيز عالية من الدياتوم مثل Chaetoceros SPP. يحتمل أن تكون ضارة لنمو O. dioica لأنها يمكن أن تمتلك setae طويلة التي يمكن أن تسد المنزل ومنع التغذية الفعالة49. لاحظنا في كثير من الأحيان منازل الحيوانات الصغيرة التي انسداد من قبل C. calcitrans setae; لذلك، نحن الآن تغذية C. calcitrans فقط للحيوانات في اليوم 2 وما فوق(الجدول 3).
على الرغم من أنها لم تكن مشكلة هنا, على نطاق صغير على المدى الطويل زراعة O. دييكا يمكن أن تشهد انخفاض مفاجئ في حجم السكان بسبب اختناق وراثي; في مثل هذه الحالات، يوصي Martí-Solans وآخرون29 بإضافة أفراد جدد من البرية إلى الثقافة كل 20 جيلًا.
نظام ثقافة Oikopleura مرن. ويمكن تأسيس ثقافة مستقرة في غضون أسبوع. من الممكن زراعة أو دييكا على المدى الطويل على ميزانية متواضعة مع معدات غير متخصصة. الجهد اليومي اللازم للحفاظ على 5-10 قارور من أوكوبلوبورا هو عادة أقل من 2 ساعة مع 2 الناس. O. يمكن الحفاظ على ديويكا أيضا في مياه البحر الاصطناعية، وهو أمر مفيد لأولئك الذين لا يستطيعون الوصول إلى مياه البحر الطبيعية28. التخزين طويل الأجل من المواد الغذائية الطحالب ممكن باستخدام ثقافة صلبة و التبريد29. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون o. الحيوانات المنوية دييكا cryopreserved، وتبقى قابلة للحياة لأكثر من عام50. وكل هذه العوامل تعني أنه يمكن إعادة الثقافات بسهولة. وأخيرا ، تجربة الماضي مع زراعة عرضي من Pleurobrachia sp. قد تشير إلى أن نظام زراعة التي وضعت لأوكبلورا يمكن أن تمتد إلى مجتمع أوسع من الكائنات العضوية البحرية الهشة.
O. دييكا تواصل تقديم رؤى قوية في مختلف المجالات البيولوجية. إن فهم الموسمية المحلية، ونظام الثقافة الدقيق، وعدد قليل من الأفراد المتفانين يسمح بنشأة ثقافة فعالة مع القليل من الجهد. يوفر نظام أوكوببورا للثقافة الموارد الأساسية لدراسة مجموعة واسعة من المجالات البيولوجية المتعلقة بالبيئة والتنمية وعلم الجينوم وتطور هذه الوترات البحرية الفريدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لغارث إلسلي لدعمه في إنشاء النظام الثقافي. ونحن نعترف مساهمات ريتسوكو سوياما وسيلفان غيلوت في جهود أخذ العينات المبكرة وتحديد الأنواع. ومن المقرر شكر خاص لهيروكي نيشيدا، اكيشي أوناما، وتاتسويا أوموتزاكو لدعمهم وتوجيههم السخي في جميع أنحاء، بما في ذلك إنشاء أولي لنظام الاستزراع المحلي وتقاسم الحيوانات والثقافة الصغيرة. كما نشكر دانيال شوروت، وجان ماري بوكيه، وآن أسيوورد، وكريستيان كانيسترو، وألفونسو فيرناديز – رولدان لتقاسم خبراتهم في أخذ العينات والاستزراع. قدم جاي دينتون وتشارلز بلازي وجيفري جولي تعليقات لا تقدر بثمن على المخطوطة. وضعت شارلوت ويست معادلة معممة لحساب الطحالب. وأخيراً، نشكر OIST على التمويل، وماري كولينز ولجنة سلامة العمل الميداني التابعة لمنظمة “أوست” للحصول على المشورة بشأن إجراءات أخذ العينات الآمنة، وموظفي متجر آلات OIST لبناء معدات الزراعة وأخذ العينات، وكويتشي تودا لتسليم مياه البحر.
Materials
| Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
| Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
| Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
| Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
| Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
| Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
| Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
| Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
| Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
| TCW-5N-PPS | |||
| TCW-1N-PPS | |||
| Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
| Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
| Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
| Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
| Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
| Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
| UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
| Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |
References
- Travis, J. Is It What We Know or Who We Know? Choice of Organism and Robustness of Inference in Ecology and Evolutionary Biology (American Society of Naturalists Presidential Address). The American Naturalist. 167 (3), 303-314 (2006).
- Jenner, R. A., Wills, M. A. The choice of model organisms in evo-devo. Nature Reviews Genetics. 8 (4), 311-314 (2007).
- Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
- Wilson, S., Ruhl, H., Smith, J. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Steinberg, D. K., Lomas, M. W., Cope, J. S. Long-term increase in mesozooplankton biomass in the Sargasso Sea: Linkage to climate and implications for food web dynamics and biogeochemical cycling. Global Biogeochemical Cycles. 26 (1), 1004 (2012).
- Lombard, F., Kiørboe, T. Marine snow originating from appendicularian houses: Age-dependent settling characteristics. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers. 57 (10), 1304-1313 (2010).
- Fenaux, R., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 251-264 (1998).
- Hopcroft, R. R., Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. . Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , 45-57 (2005).
- Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e59832 (2019).
- Deibel, D. Feeding mechanism and house of the appendicularian Oikopleura vanhoeffeni. Marine Biology. 93 (3), 429-436 (1986).
- Spada, F., et al. Molecular patterning of the oikoplastic epithelium of the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 20624-20632 (2001).
- Flood, P. R., Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. . Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , 59-85 (2005).
- Tokioka, T. Studies on the distribution of appendicularians and some thaliaceans of the North Pacific, with some morphological notes. Publication of the Seto Marine Biological Laboratory. (8), 351-443 (1960).
- Alldredge, A. L. Discarded appendicularian houses as sources of food, surface habitats, and particulate organic matter in planktonic environments. Limnology and Oceanography. 21 (1), 14-24 (1976).
- Clarke, C., Roff, J. C. Abundance and biomass of herbivorous zooplankton off Kingston, Jamaica, with estimates of their annual production. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 31 (4), 423-437 (1990).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Zooplankton growth rates: extraordinary production by the larvacean Oikopleura dioica in tropical waters. Journal of Plankton Research. 17 (2), 205-220 (1995).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Production of tropical larvaceans in Kingston Harbour, Jamaica: are we ignoring an important secondary producer. Journal of Plankton Research. 20 (3), 557-569 (1998).
- Mochioka, N., Iwamizu, M. Diet of anguilloid larvae: leptocephali feed selectively on larvacean houses and fecal pellets. Marine Biology. 125 (3), 447-452 (1996).
- Sakaguchi, S. O., et al. Morphological identity of a taxonomically unassigned cytochrome c oxidase subunit i sequence from stomach contents of juvenile chum salmon determined using polymerase chain reaction. Fisheries Science. 83 (5), 757-765 (2017).
- Fenaux, R., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 25-34 (1998).
- Sato, R., Tanaka, Y., Ishimaru, T. House production by Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) under laboratory conditions. Journal of Plankton Research. 23 (4), 415-423 (2001).
- Flood, R., Deibel, D., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 105-124 (1998).
- Alldredge, A., Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. . Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , 309-326 (2005).
- Katija, K., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. New technology reveals the role of giant larvaceans in oceanic carbon cycling. Science Advances. 3 (5), 1602374 (2017).
- Katija, K., Choy, C. A., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. From the surface to the seafloor: How giant larvaceans transport microplastics into the deep sea. Science Advances. 3 (8), 1700715 (2017).
- Hidaka, K. Species composition and horizontal distribution of the appendicularian community in waters adjacent to the Kuroshio in winter-early spring. Plankton and Benthos Research. 3 (3), 152-164 (2008).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359-370 (2009).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: culture, genome, and cell lineages. Development, Growth & Differentiation. 50, 239-256 (2008).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica culturing made easy: A Low-Cost facility for an emerging animal model in Evo Devo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), 146-152 (2016).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Seo, H. C., et al. Miniature genome in the marine chordate Oikopleura dioica. Science. 294 (5551), 2506 (2001).
- Fredriksson, G., Olsson, R. The subchordal cells of Oikopleura dioica and O. albicans (Appendicularia, Chordata). Acta Zoologica. 72 (4), 251-256 (1991).
- Paffenhöfer, G. A. The cultivation of an appendicularian through numerous generations. Marine Biology. 22 (2), 183-185 (1973).
- Fenaux, R., Gorsky, G. Nouvelle technique d’élevage des appendiculaires. Rapports et Procés-Verbaux des Réunions-Commission Internationale pour l’Exploration Scientifique de la Mer Méditerranée. 29, 291-292 (1985).
- Fujii, S., Nishio, T., Nishida, H. Cleavage pattern, gastrulation, and neurulation in the appendicularian, Oikopleura dioica. Development Genes and Evolution. 218 (2), 69-79 (2008).
- Patry, W. L., Bubel, M., Hansen, C., Knowles, T. Diffusion tubes: a method for the mass culture of ctenophores and other pelagic marine invertebrates. PeerJ. 8, 8938 (2020).
- Fenaux, R. The classification of Appendicularia (Tunicata): history and current state. Memoires de I’Institut oceanographique. , (1993).
- Shiga, N., Chihara, M., Murano, M. . Illustrated Guide to Marine Plankton in Japan. , 1393-1414 (1997).
- Gorsky, G., Castellani, C., Castellani, C., Edwards, M. . Marine Plankton: A practical guide to ecology, methodology, and taxonomy. , 599-606 (2017).
- Sato, R., Ishibashi, Y., Tanaka, Y., Ishimaru, T., Dagg, M. J. Productivity and grazing impact of Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) in Tokyo Bay. Journal of Plankton Research. 30 (3), 299-309 (2008).
- Nakamura, Y., Suzuki, K., Suzuki, S. Y., Hiromi, J. Production of Oikopleura dioica (Appendicularia) following a picoplankton ‘bloom’in a eutrophic coastal area. Journal of Plankton Research. 19 (1), 113-124 (1997).
- Nakamura, Y. Blooms of tunicates Oikopleura spp. and Dolioletta gegenbauri in the Seto Inland Sea, Japan, during summer. Hydrobiologia. 385 (1-3), 183-192 (1998).
- Uye, S. I., Ichino, S. Seasonal variations in abundance, size composition, biomass and production rate of Oikopleura dioica (Fol)(Tunicata: Appendicularia) in a temperate eutrophic inlet. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 189 (1-2), 1-11 (1995).
- Tsuchiya, K., et al. Phytoplankton community response and succession in relation to typhoon passages in the coastal waters of Japan. Journal of Plankton Research. 36 (2), 424-438 (2014).
- Lopez-Lopez, L., et al. Effects of typhoons on gelatinous carnivore zooplankton off Northern Taiwan. Cahiers de Biologie Marine. 53, 349-355 (2012).
- Ares, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Extreme storm-induced run-off causes rapid, context-dependent shifts in nearshore subtropical bacterial communities. bioRxiv. , (2019).
- Torres-Águila, N. P., et al. Diatom bloom-derived biotoxins cause aberrant development and gene expression in the appendicularian chordate Oikopleura dioica. Communications Biology. 1 (1), 1-11 (2018).
- Troedsson, C., Frischer, M. E., Nejstgaard, J. C., Thompson, E. M. Molecular quantification of differential ingestion and particle trapping rates by the appendicularian Oikopleura dioica as a function of prey size and shape. Limnology and Oceanography. 52 (1), 416-427 (2007).
- Ouchi, K., Nishino, A., Nishida, H. Simple procedure for sperm cryopreservation in the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Zoological Science. 28 (1), 8-11 (2011).
