Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores

La barrera hematoencefálica (BBB) es un obstáculo importante para la entrega de fármacos en el parénquima cerebral. La mayoría de los fármacos terapéuticos que se han desarrollado no cruzan el BBB debido a sus parámetros fisicoquímicos (por ejemplo, lipofilia, peso molecular, aceptores de enlaces de hidrógeno y donantes) o no se retienen debido a su afinidad por los transportadores de eflujo en el cerebro^1,2. El pequeño grupo de fármacos que pueden atravesar el BBB son típicamente pequeñas moléculas lipofílicas, que sólo son eficaces en un número limitado de enfermedades cerebrales^1,2. Como consecuencia, para la mayoría de las enfermedades cerebrales, las opciones de tratamiento farmacológico son limitadas y se necesitan nuevas estrategias de administración de fármacos^3,4.

El ultrasonido terapéutico es una técnica emergente que se puede utilizar para diferentes aplicaciones neurológicas como la interrupción de BBB (BBBD), la neuromodulación y la ablación^4,5,6,7. Para lograr una apertura de BBB con un emisor de ultrasonido extracorpóreo a través del cráneo, el ultrasonido enfocado (FUS) se combina con microburbujas. Fus mediada por microburbujas resulta en un aumento de la biodisponibilidad de los fármacos en el parénquima cerebral^5,8,9. En presencia de ondas sonoras, las microburbujas comienzan a oscilar iniciando la transcitosis y la interrupción de las uniones estrechas entre las células endoteliales del BBB, permitiendo el transporte paracelular de moléculas más grandes¹⁰. Estudios previos confirmaron la correlación entre la intensidad de la emisión acústica y el impacto biológico en la apertura BBB^11,12,13,14. Fus en combinación con microburbujas ya se ha utilizado en ensayos clínicos para el tratamiento del glioblastoma utilizando temozolomida o doxorrubicina liposomal como agente quimioterapéutico, o para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica^5,9,15,16.

Puesto que el ultrasonido medió los resultados de la abertura de BBB en las posibilidades enteramente nuevas para la farmacoterapia, la investigación preclínica para la traducción clínica es necesaria evaluar la respuesta de la terapia de candidatos seleccionados de la droga. Esto normalmente requiere un flujo de trabajo de alto rendimiento con alta precisión espacial y preferiblemente una detección de cavitación integrada para la supervisión de la apertura BBB dirigida con una alta reproducibilidad. Si es posible, estos sistemas deben ser rentables tanto en la inversión inicial como en los costos de funcionamiento para ser escalables de acuerdo con el tamaño del estudio. La mayoría de los sistemas fus preclínicos se combinan con mri para la imagen-dirección y la planificación del tratamiento^15,17,18,19. Aunque la RMN proporciona información detallada sobre la anatomía y el volumen del tumor, es una técnica costosa, que generalmente es realizada por operadores capacitados /calificados. Además, la RMN de alta resolución puede no estar siempre disponible para los investigadores en instalaciones preclínicas y requiere largos tiempos de exploración por animal, lo que la hace menos adecuada para estudios farmacológicos de alto rendimiento. Cabe destacar que, para la investigación preclínica en el campo de la neurooncología, en particular los modelos tumorales infiltrativos, la posibilidad de visualizar y atacar el tumor es esencial para el éxito del tratamiento^20. Actualmente, este requisito sólo se cumple por RMN o por tumores transducidos con una fotoproteína, lo que permite la visualización con imágenes de bioluminiscencia (BLI) en combinación con la administración del sustrato fotoproteico.

Los sistemas FUS guiados por RMN a menudo utilizan un baño de agua para asegurar la propagación de ondas de ultrasonido para aplicaciones transcraneales, mediante el cual la cabeza del animal está parcialmente sumergida en el agua, los llamados sistemas ”bottom-up”^15,17,18. Si bien estos diseños funcionan generalmente bien en estudios con animales más pequeños, son un compromiso entre los tiempos de preparación de los animales, la portabilidad y los estándares higiénicos realistas y mantenibles durante el uso. Como alternativa a la RMN, otros métodos de guía para la navegación estereotáctica abarcan el uso de un atlas anatómico de roedores^{21,22, 23,}avistamiento visual asistido por puntero láser^24,dispositivo de escaneo mecánico asistido por agujero de alfiler²⁵o BLI^26. La mayoría de estos diseños son sistemas “de arriba hacia abajo” en los que el transductor se coloca en la parte superior de la cabeza del animal, con el animal en una posición natural. El flujo de trabajo ”de arriba hacia abajo” consiste en un baño de agua^22,25,26 o un cono lleno de agua^21,24. La ventaja de usar un transductor dentro de un cono cerrado es la huella más compacta, el menor tiempo de configuración y las posibilidades de descontaminación directa que simplifican todo el flujo de trabajo.

La interacción del campo acústico con las microburbujas depende de la presión y va desde oscilaciones de baja amplitud (denominadas cavitación estable) hasta colapso transitorio de burbujas (denominada cavitación inercial)^27,28. Existe un consenso establecido de que la ECOGRAFÍA-BBBD requiere una presión acústica muy por encima del umbral de cavitación estable para lograr una BBBD exitosa, pero por debajo del umbral de cavitación inercial, que generalmente se asocia con daño vascular/neuronal^29. La forma más común de monitoreo y control es el análisis de la señal acústica (retro)dispersada utilizando la detección pasiva de cavitación (PCD), como sugieren McDannold et al.^12. Pcd se basa en el análisis de los espectros de Fourier de señales de emisión de microburbujas, en el que la fuerza y la apariencia de los sellos de cavitación estables (armónicos, subharmonics y ultraharmonics) y los marcadores de cavitación inercial (respuesta de banda ancha) se pueden medir en tiempo real.

Un análisis pcd de “talla única” para un control preciso de la presión es complicado debido a la polidispersidad de la formulación de microburbujas (la amplitud de la oscilación depende fuertemente del diámetro de la burbuja), las diferencias en las propiedades de la cáscara de la burbuja entre las marcas y la oscilación acústica, que depende fuertemente de la frecuencia y la presión^30,31,32. Como consecuencia, se han sugerido muchos protocolos diferentes de detección de PCD, que se han adaptado a combinaciones particulares de todos estos parámetros y se han utilizado en varios escenarios de aplicación (que van desde la experimentación in vitro sobre protocolos de pequeños animales hasta PCD para uso clínico) para la detección de cavitación robusta e incluso para el control de retroalimentación retroactiva de la presión^{11,14,30,31,32,33,34,35.} El protocolo PCD empleado en el alcance de este estudio se deriva directamente de McDannold et al.¹² y monitorea la emisión armónica para la presencia de cavitación estable y ruido de banda ancha para la detección de cavitación inercial.

Hemos desarrollado un sistema de FUS de neuronavegación guiada por imágenes para la apertura transitoria del BBB para aumentar la entrega de fármacos en el parénquima cerebral. El sistema se basa en componentes disponibles comercialmente y se puede adaptar fácilmente a varias modalidades de imágenes diferentes, dependiendo de las técnicas de imagen disponibles en la instalación animal. Dado que requerimos un flujo de trabajo de alto rendimiento, hemos optado por utilizar rayos X y BLI para la orientación por imágenes y la planificación del tratamiento. Las células tumorales transducidas con una fotoproteína (por ejemplo, luciferasa) son adecuadas para la obtención de imágenes^{BLI 20}. Después de la administración del sustrato de fotoproteínas, las células tumorales pueden ser monitoreadas in vivo y el crecimiento y la ubicación del tumor se pueden determinar^20,36. BLI es una modalidad de imagen de bajo costo, permite seguir el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo, tiene tiempos de exploración rápidos y se correlaciona bien con el crecimiento tumoral medido con MRI^36,37. Hemos optado por sustituir el baño de agua por un cono lleno de agua unido al transductor para permitir flexibilidad para mover libremente la plataforma sobre la que está montado el roedor^8,24. El diseño se basa en una plataforma desmontable equipada con la integración de (I) plataforma estereotáctica de animales pequeños (II) marcadores fiduciales con rayos X y compatibilidad de imágenes ópticas (III) máscara de anestesia desmontable rápida, y (IV) sistema integrado de calentamiento de animales regulados por temperatura. Después de la inducción inicial de la anestesia, el animal se monta en una posición precisa en la plataforma donde permanece durante todo el procedimiento. En consecuencia, toda la plataforma pasa por todas las estaciones del flujo de trabajo de toda la intervención, manteniendo un posicionamiento preciso y reproducible y anestesia sostenida. El software de control permite la detección automática de los marcadores fiduciales y registra automáticamente todo tipo de imágenes y modalidades de imagen (es decir, micro-CT, rayos X, BLI e imágenes de fluorescencia) en el marco de referencia de la plataforma estereotáctica. Con la ayuda de un procedimiento de calibración automática, la distancia focal del transductor de ultrasonido se conoce con precisión dentro, lo que permite la fusión automática de la planificación intervencionista, la entrega acústica y el análisis de imágenes de seguimiento. Como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2,esta configuración proporciona un alto grado de flexibilidad para diseñar flujos de trabajo experimentales dedicados y permite el manejo intercalado del animal en diferentes estaciones, lo que a su vez facilita los experimentos de alto rendimiento. Hemos utilizado esta técnica para la entrega acertada de la droga en xenografts del ratón de la glioma de alto grado tal como glioma difuso del midline.