Um sistema de neuronação estereática guiada por imagem de alta produtividade e sistema de ultrassom focado para abertura de barreira hemencefálica em roedores

A barreira hematoencefálica (BBB) é um grande obstáculo para a entrega de drogas no cérebro. A maioria das drogas terapêuticas desenvolvidas não atravessam o BBB devido aos seus parâmetros físico-químicos (por exemplo, lipoficidade, peso molecular, aceitadores de vínculos de hidrogênio e doadores) ou não são retidos devido à sua afinidade com transportadores efflux no cérebro^1,2. O pequeno grupo de drogas que podem atravessar o BBB são tipicamente pequenas moléculas lipofílicas, que só são eficazes em um número limitado de doenças cerebrais^1,2. Como consequência, para a maioria das doenças cerebrais, as opções de tratamento farmacológico são limitadas e novas estratégias de entrega de medicamentos são necessárias^3,4.

O ultrassom terapêutico é uma técnica emergente que pode ser usada para diferentes aplicações neurológicas, como ruptura BBB (BBBD), neuromodulação e ablação^4,5,6,7. Para conseguir uma abertura BBB com um emissor de ultrassom extracorpórea através do crânio, o ultrassom focado (FUS) é combinado com microbolhas. O MEC mediado por microconstrução resulta no aumento da biodisponibilidade de drogas no cérebro parenchyma^5,8,9. Na presença de ondas sonoras, os microbolhas começam a oscilar iniciando a transcitose e a interrupção das junções apertadas entre as células endoteliais do BBB, permitindo o transporte paracelular de moléculas maiores¹⁰. Estudos anteriores confirmaram a correlação entre a intensidade da emissão acústica e o impacto biológico na abertura do BBB^11,12,13,14. O FUS em combinação com microbolhas já tem sido utilizado em ensaios clínicos para o tratamento de glioblastoma usando temozolomide ou doxorubicina liposômica como agente quimioterápico, ou para terapia da doença de Alzheimer e esclerose lateral amiotrófica^5,9,15,16.

Uma vez que a abertura do BBB mediado pelo ultrassom resulta em possibilidades totalmente novas para farmacoterapia, é necessária pesquisa pré-clínica para tradução clínica para avaliar a resposta terapêutica de candidatos a medicamentos selecionados. Isso normalmente requer um fluxo de trabalho de alto rendimento com precisão espacial elevada e, preferencialmente, uma detecção integrada de cavitação para monitoramento da abertura do BBB com uma alta reprodutibilidade. Se possível, esses sistemas precisam ser econômicos tanto no investimento inicial quanto nos custos de execução, para serem escaláveis de acordo com o tamanho do estudo. A maioria dos sistemas de FUS pré-clínicos são combinados com ressonância magnética para orientação de imagem e planejamento de tratamento^15,17,18,19. Embora a ressonância magnética dê informações detalhadas sobre a anatomia e o volume do tumor, é uma técnica cara, que geralmente é realizada por operadores treinados/qualificados. Além disso, a ressonância magnética de alta resolução pode nem sempre estar disponível para pesquisadores em instalações pré-clínicas e requer longos tempos de varredura por animal, tornando-o menos adequado para estudos farmacológicos de alto rendimento. Destaca-se que, para pesquisas pré-clínicas no campo da neuro-oncologia, em especial modelos de tumores infiltrados, a possibilidade de visualizar e atingir o tumor é essencial para o sucesso do tratamento²⁰. Atualmente, essa exigência só é cumprida por ressonância magnética ou por tumores transduzidos com fotoproteína, possibilitando visualização com bioluminescência de imagem (BLI) em combinação com a administração do substrato de fotoproteína.

Os sistemas de FUS guiados por ressonância magnética frequentemente usam um banho de água para garantir a propagação de ondas de ultrassom para aplicações transcranianas, em que a cabeça do animal está parcialmente submersa na água, os chamados sistemas ”bottom-up”^15,17,18. Embora esses projetos funcionem geralmente bem em estudos em animais menores, eles são um compromisso entre os tempos de preparação animal, portabilidade e padrões higiênicos realisticamente mantidos durante o uso. Como alternativa à ressonância magnética, outros métodos de orientação para navegação estereotática abrangem o uso de um atlas anatômico de roedores^21,22,23, ponteiro laser assistido ao avistamento visual²⁴, dispositivo de varredura mecânica assistido por pinhole²⁵, ou BLI²⁶. A maioria desses desenhos são sistemas “de cima para baixo” em que o transdutor é colocado em cima da cabeça do animal, com o animal em uma posição natural. O fluxo de trabalho ”top-down” consiste em um banho de água^22,25,26 ou um cone cheio de água^21,24. O benefício de usar um transdutor dentro de um cone fechado é a pegada mais compacta, menor tempo de configuração e possibilidades de descontaminação direta simplificando todo o fluxo de trabalho.

A interação do campo acústico com os microbolhas é dependente da pressão e varia de oscilações de baixa amplitude (chamada de cavitação estável) ao colapso transitório da bolha (referido como cavitação inercial)^27,28. Há um consenso estabelecido de que o ultrassom-BBBD requer uma pressão acústica bem acima do limiar de cavitação estável para alcançar o sucesso do BBBD, mas abaixo do limiar de cavitação inercial, que geralmente está associado a danos vasculares/neuronais²⁹. A forma mais comum de monitoramento e controle é a análise do (back-)sinal acústico disperso utilizando detecção passiva de cavitação (PCD), conforme sugerido por McDannold et al.¹². O PCD baseia-se na análise dos espectros fourier de sinais de emissão de microbolhas, nos quais a força e o aparecimento de marcas de cavitação estáveis (harmônicas, subharmônicas e ultraharmônicas) e marcadores de cavitação inercial (resposta de banda larga) podem ser medidos em tempo real.

Uma análise de PCD “de um tamanho” para controle preciso de pressão é complicada devido à polidispersidade da formulação de microbolhas (a amplitude de oscilação depende fortemente do diâmetro da bolha), as diferenças nas propriedades da casca de bolha entre as marcas e a oscilação acústica, que depende fortemente da frequência e da pressão^30,31,32. Como consequência, muitos protocolos diferentes de detecção de PCD foram sugeridos, que foram adaptados a combinações particulares de todos esses parâmetros e têm sido usados em vários cenários de aplicação (que vão desde experimentações in vitro sobre pequenos protocolos animais até PCD para uso clínico robusto) para detecção robusta de cavitação e até mesmo para controle retroativo de feedback da pressão^{11,14,30,31,32,33,34,35}. O protocolo PCD empregado no escopo deste estudo é derivado diretamente de McDannold et al.¹² e monitora a emissão harmônica para a presença de cavitação estável e ruído de banda larga para detecção inercial de cavitação.

Desenvolvemos um sistema de ME FUS de neuronavigção guiado por imagem para abertura transitória do BBB para aumentar a entrega de drogas no parênquim cerebral. O sistema é baseado em componentes disponíveis comercialmente e pode ser facilmente adaptado a diversas modalidades de imagem diferentes, dependendo das técnicas de imagem disponíveis na instalação animal. Como exigimos um fluxo de trabalho de alto rendimento, optamos por usar raio-X e BLI para orientação de imagem e planejamento de tratamento. As células tumorais transduzidas com uma fotoproteína (por exemplo, luciferase) são adequadas para a imagem^{BLI 20}. Após a administração do substrato de fotoproteína, as células tumorais podem ser monitoradas in vivo e o crescimento e localização do tumor podem ser determinados^20,36. A BLI é uma modalidade de imagem de baixo custo, permite acompanhar o crescimento do tumor ao longo do tempo, tem tempos de varredura rápidos e se correlaciona bem com o crescimento do tumor medido com ressonância magnética^36,37. Optamos por substituir o banho de água por um cone cheio de água ligado ao transdutor para permitir flexibilidade para mover livremente a plataforma em que o roedor é montado^8,24. O design é baseado em uma plataforma destacável equipada com integração de (I) marcadores fiduciais de plataforma estereustática (II) de pequena animal com máscara de compatibilidade de imagem x e óptica (III) de alta destastésia rápida e (IV) sistema de aquecimento animal regulado pela temperatura integrada. Após a indução inicial da anestesia, o animal é montado em uma posição precisa na plataforma onde permanece durante todo o procedimento. Consequentemente, toda a plataforma passa por todas as estações do fluxo de trabalho de toda a intervenção, mantendo um posicionamento preciso e reprodutível e anestesia sustentada. O software de controle permite a detecção automática dos marcadores fiduciais e registra automaticamente todos os tipos de imagens e modalidades de imagem (ou seja, micro-CT, raio-X, BLI e imagem de fluorescência) no quadro de referência da plataforma estereotática. Com a ajuda de um procedimento de calibração automática, a distância focal do transdutor de ultrassom é precisamente conhecida dentro, o que permite a fusão automática do planejamento intervencionista, entrega acústica e análise de imagem de acompanhamento. Como mostrado na Figura 1 e Figura 2,esta configuração fornece um alto grau de flexibilidade para projetar fluxos de trabalho experimentais dedicados e permite o manuseio intercalado do animal em diferentes estações, o que, por sua vez, facilita experimentos de alto rendimento. Usamos esta técnica para a entrega bem sucedida de drogas em xenoenxertos de rato de glioma de alto grau, como glioma midline difuso.