Un neuronavigation stereotattico guidato da immagini ad alta produttività e un sistema ad ultrasuoni focalizzati per l'apertura della barriera ematico-encefalica nei roditori

La barriera ematica-encefalica (BBB) è un grosso ostacolo per il somministrazione di farmaci nel parenchima cerebrale. La maggior parte dei farmaci terapeutici che sono stati sviluppati non attraversano la BBB a causa dei loro parametri fisicochimici (ad esempio, lipofilia, peso molecolare, accettori di legami idrogeno e donatori) o non vengono mantenuti a causa della loro affinità per i trasportatori di efflux nel^{cervello 1,2}. Il piccolo gruppo di farmaci che possono attraversare la BBB sono tipicamente piccole molecole lipofile, che sono efficaci solo in un numero limitato di malattie^{cerebrali 1,2}. Di conseguenza, per la maggior parte delle malattie cerebrali, le opzioni di trattamento farmacologico sono limitate e sono necessarie nuove strategie di^{somministrazione dei farmaci 3,4}.

L’ecografia terapeutica è una tecnica emergente che può essere utilizzata per diverse applicazioni neurologiche come l’interruzione della BBB (BBBD), la neuromodulazione e l’ablazione^4,5,6,7. Al fine di ottenere un’apertura BBB con un emettitore ad ultrasuoni extracorporeo attraverso il cranio, gli ultrasuoni focalizzati (FUS) sono combinati con microbolle. Il FUS mediato da microbolle si traduce in una maggiore biodisponibilità di farmaci nel parenchima^{cerebrale 5,8,9}. In presenza di onde sonore, le microbolle iniziano a oscillare iniziando la tracitosi e l’interruzione delle giunzioni strette tra le cellule endoteliali della BBB, consentendo il trasporto paracellulare di molecole più^{grandi 10}. Studi precedenti hanno confermato la correlazione tra l’intensità dell’emissione acustica e l’impatto biologico sull’apertura della BBB^11,12,13,14. FUS in combinazione con microbolle è già stato utilizzato in studi clinici per il trattamento del glioblastoma utilizzando temozolomide o doxorubicina liposomiale come agente chemioterapico, o per la terapia del morbo di Alzheimer e sclerosi laterale amiotrofica^5,9,15,16.

Poiché l’apertura della BBB mediata da ultrasuoni si traduce in possibilità completamente nuove per la farmacoterapia, è necessaria una ricerca preclinica per la traduzione clinica per valutare la risposta terapeutica di candidati selezionati. Ciò richiede in genere un flusso di lavoro ad alta produttività con precisione sia spaziale elevata che preferibilmente un rilevamento di cavitazione integrato per il monitoraggio dell’apertura BBB mirata con un’elevata riproducibilità. Se possibile, questi sistemi devono essere convenienti sia per gli investimenti iniziali che per i costi di gestione per essere scalabili in base alle dimensioni dello studio. La maggior parte dei sistemi FUS preclinici sono combinati con la risonanza prima della mento per la guida delle immagini e la^{pianificazione del trattamento 15,17,18,19}. Sebbene la risonanza tura dia informazioni dettagliate sull’anatomia e sul volume del tumore, è una tecnica costosa, che viene generalmente eseguita da operatori addestrati / qualificati. Inoltre, la risonanza prima o poi ad alta risoluzione potrebbe non essere sempre disponibile per i ricercatori in strutture precliniche e richiede lunghi tempi di scansione per animale, rendendola meno adatta per studi farmacologici ad alta produttività. Degno di nota è che, per la ricerca preclinica nel campo della neuro-oncologia, in particolare dei modelli tumorali infiltrativi, la possibilità di visualizzare e indirizzare il tumore è essenziale per il successo^{del trattamento 20}. Attualmente, questo requisito è soddisfatto solo dalla risonanza magnetica o da tumori trasdotti con una fotoproteina, consentendo la visualizzazione con imaging a bioluminescenza (BLI) in combinazione con la somministrazione del substrato di fotoproteina.

I sistemi FUS guidati dalla risonanza 10 utilizzano spesso un bagno d’acqua per garantire la propagazione delle onde ultrasoniche per applicazioni transcranici, in cui la testa dell’animale è parzialmente sommersa nell’acqua, i cosiddetti sistemi “bottom-up”^15,17,18. Mentre questi progetti funzionano generalmente bene negli studi sugli animali più piccoli, sono un compromesso tra tempi di preparazione degli animali, portabilità e standard igienici realisticamente manutenibili durante l’uso. In alternativa alla risonanza valutazione, altri metodi di guida per la navigazione stereotassica comprendono l’uso di un atlante anatomico roditore^21,22,23, avvistamento visivo assistito da puntatore laser^24,dispositivo di scansione meccanica assistito da fori stenopeico²⁵o BLI²⁶. La maggior parte di questi disegni sono sistemi “top-down” in cui il trasduttore è posto sopra la testa dell’animale, con l’animale in posizione naturale. Il flusso di lavoro “dall’alto verso il basso” è costituito da un bagno^{d’acqua 22,25,26} o da un cono riempito d’acqua^21,24. Il vantaggio dell’utilizzo di un trasduttore all’interno di un cono chiuso è l’ingombro più compatto, i tempi di configurazione più brevi e le possibilità di decontaminazione diretta semplificando l’intero flusso di lavoro.

L’interazione del campo acustico con le microbolle dipende dalla pressione e varia dalle oscillazioni a bassa ampiezza (indicate come cavitazione stabile) al collasso transitorio della bolla (indicato come cavitazione inerziale)^27,28. Esiste un consenso consolidato sul fatto che l’ecografia-BBBD richiede una pressione acustica ben al di sopra della soglia di cavitazione stabile per ottenere un BBBD di successo, ma al di sotto della soglia di cavitazione inerziale, che è generalmente associata a danni vascolari /^{neuronali 29}. La forma più comune di monitoraggio e controllo è l’analisi del segnale acustico (back-)scattered utilizzando il rilevamento passivo della cavitazione (PCD), come suggerito da McDannold et^al. La PCD si basa sull’analisi degli spettri di Fourier dei segnali di emissione di microbolle, in cui la forza e l’aspetto dei tratti distintivi di cavitazione stabili (armoniche, sottoarmoniche e ultraarmoniche) e dei marcatori di cavitazione inerziale (risposta a banda larga) possono essere misurati in tempo reale.

Un’analisi PCD “one size fits all” per un controllo preciso della pressione è complicata a causa della polidispersità della formulazione di microbolle (l’ampiezza di oscillazione dipende fortemente dal diametro della bolla), dalle differenze nelle proprietà del guscio della bolla tra le marche e dall’oscillazione acustica, che dipende fortemente dalla^{frequenza e dalla pressione 30,31,32}. Di conseguenza, sono stati suggeriti molti diversi protocolli di rilevamento PCD, che sono stati adattati a particolari combinazioni di tutti questi parametri e sono stati utilizzati in vari scenari applicativi (che vanno dalla sperimentazione in vitro su piccoli protocolli animali alla PCD per uso clinico) per il rilevamento robusto della cavitazione e persino per il controllo retroattivo del feedback^{della pressione 11,14,30,31,32,33,34,35}. Il protocollo PCD utilizzato nell’ambito di questo studio è derivato^direttamente da McDannold et al.

Abbiamo sviluppato un sistema FUS di neuronavigation guidato da immagini per l’apertura transitoria della BBB per aumentare il consumo di farmaci nel parenchima cerebrale. Il sistema si basa su componenti disponibili in commercio e può essere facilmente adattato a diverse modalità di imaging, a seconda delle tecniche di imaging disponibili nella struttura animale. Poiché abbiamo bisogno di un flusso di lavoro ad alta produttività, abbiamo scelto di utilizzare raggi X e BLI per la guida delle immagini e la pianificazione del trattamento. Le cellule tumorali trasdute con una fotoproteina (ad esempio, luciferasi) sono adatte per l’imaging BLI²⁰. Dopo la somministrazione del substrato di fotoproteina, le cellule tumorali possono essere monitorate in vivo e la crescita e la posizione del tumore^{possono essere determinate 20,36}. BLI è una modalità di imaging a basso costo, consente di seguire la crescita tumorale nel tempo, ha tempi di scansione rapidi e si correla bene con la crescita tumorale misurata con la risonanza^{magnetica 36,37}. Abbiamo optato per sostituire il bagno d’acqua con un cono pieno d’acqua attaccato al trasduttore per consentire flessibilità per spostare liberamente la piattaforma su cui è^{montato il roditore 8,24}. Il design si basa su una piattaforma rimovibile dotata di integrazione di (I) marcatori fiduciari della piattaforma stereotattica per piccoli animali (II) con compatibilità a raggi X e immagini ottiche (III) maschera di anestesia rapidamente rimovibile e (IV) sistema integrato di riscaldamento degli animali regolato dalla temperatura. Dopo l’induzione iniziale dell’anestesia, l’animale viene montato in una posizione precisa sulla piattaforma dove rimane durante l’intera procedura. Di conseguenza, l’intera piattaforma passa tutte le stazioni del flusso di lavoro dell’intero intervento, pur mantenendo un posizionamento accurato e riproducibile e un’anestesia sostenuta. Il software di controllo consente il rilevamento automatico dei marcatori fiduciari e registra automaticamente tutti i tipi di immagini e modalità di immagine (ad esempio, micro-CT, raggi X, BLI e imaging a fluorescenza) nel quadro di riferimento della piattaforma stereotassica. Con l’aiuto di una procedura di calibrazione automatica, la lunghezza focale del trasduttore ad ultrasuoni è precisamente nota all’interno, il che consente la fusione automatica della pianificazione interventiva, della consegna acustica e dell’analisi di imaging di follow-up. Come illustrato nella figura 1 e nella figura 2, questa configurazione offre un elevato grado di flessibilità per progettare flussi di lavoro sperimentali dedicati e consente la manipolazione interfogliata dell’animale in diverse stazioni, il che a sua volta facilita gli esperimenti ad alta produttività. Abbiamo usato questa tecnica per il successo della somministrazione di farmaci negli xenografti di topo di glioma di alta qualità come il glioma medioline diffuso.