Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een groot obstakel voor de levering van geneesmiddelen in het parenchym van de hersenen. De meeste therapeutische geneesmiddelen die zijn ontwikkeld, kruisen de BBB niet vanwege hun fysisch-chemische parameters (bijv. lipofielheid, moleculair gewicht, waterstofbindingsacceptoren en donoren) of worden niet behouden vanwege hun affiniteit voor effluxtransporters in de hersenen^1,2. De kleine groep geneesmiddelen die de BBB kunnen kruisen, zijn meestal kleine lipofiele moleculen, die slechts effectief zijn bij een beperkt aantal hersenziekten^1,2. Als gevolg hiervan zijn voor de meeste hersenziekten de farmacologische behandelingsopties beperkt en zijn nieuwe strategieën voor de toediening van geneesmiddelen nodig^3,4.

Therapeutische echografie is een opkomende techniek die kan worden gebruikt voor verschillende neurologische toepassingen zoals BBB-verstoring (BBBD), neuromodulatie en ablatie^4,5,6,7. Om een BBB-opening te bereiken met een extracorporale echografie-emitter door de schedel, wordt gerichte echografie (FUS) gecombineerd met microbubbels. Microbubble-gemedieerde FUS resulteert in een verhoogde biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen in het hersenparenchym^5,8,9. In aanwezigheid van geluidsgolven beginnen microbubbels te oscilleren bij het initiëren van transcytose en verstoring van de nauwe verbindingen tussen de endotheelcellen van de BBB, waardoor paracellulair transport van grotere moleculen mogelijk wordt¹⁰. Eerdere studies bevestigden de correlatie tussen de intensiteit van de akoestische emissie en de biologische impact op de BBB-opening^11,12,13,14. FUS in combinatie met microbubbels is al gebruikt in klinische studies voor de behandeling van glioblastoom met temozolomide of liposomale doxorubicine als chemotherapeutisch middel, of voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer en amyotrofische laterale sclerose^5,9,15,16.

Aangezien echografie gemedieerde BBB-opening resulteert in geheel nieuwe mogelijkheden voor farmacotherapie, is preklinisch onderzoek voor klinische vertaling nodig om de therapierespons van geselecteerde geneesmiddelkandidaten te beoordelen. Dit vereist meestal een workflow met hoge doorvoer met zowel hoge ruimtelijke precisie als bij voorkeur een geïntegreerde cavitatiedetectie voor het bewaken van gerichte BBB-opening met een hoge reproduceerbaarheid. Indien mogelijk moeten deze systemen kosteneffectief zijn in zowel initiële investeringen als bedrijfskosten om schaalbaar te zijn op basis van de studiegrootte. De meeste preklinische FUS-systemen worden gecombineerd met MRI voor beeldbegeleiding en behandelingsplanning^15,17,18,19. Hoewel MRI gedetailleerde informatie geeft over de anatomie en het volume van de tumor, is het een dure techniek, die over het algemeen wordt uitgevoerd door getrainde / bekwame operators. Bovendien is MRI met hoge resolutie mogelijk niet altijd beschikbaar voor onderzoekers in preklinische faciliteiten en vereist het lange scantijden per dier, waardoor het minder geschikt is voor farmacologische studies met hoge doorvoer. Opmerkelijk is dat voor preklinisch onderzoek op het gebied van neuro-oncologie, in het bijzonder infiltratieve tumormodellen, de mogelijkheid om de tumor te visualiseren en te targeten essentieel is voor het succes van de behandeling²⁰. Momenteel wordt aan deze eis alleen voldaan door MRI of door tumoren die worden getransduceerd met een fotoproteïne, waardoor visualisatie met bioluminescentiebeeldvorming (BLI) in combinatie met toediening van het fotoproteïnesubstraat mogelijk is.

MRI-geleide FUS-systemen gebruiken vaak een waterbad om ultrasone golfvoortplanting te garanderen voor transcraniële toepassingen, waarbij het hoofd van het dier gedeeltelijk in het water wordt ondergedompeld, de zogenaamde ”bottom-up” systemen^15,17,18. Hoewel deze ontwerpen over het algemeen goed werken in kleinere dierstudies, zijn ze een compromis tussen de bereidingstijden van dieren, draagbaarheid en realistisch handhaafbare hygiënische normen tijdens het gebruik. Als alternatief voor MRI omvatten andere geleidingsmethoden voor stereotactische navigatie het gebruik van een anatomische atlas voor knaagdieren^21,22,23, laserpointer assisted visual sighting²⁴, pinhole-assisted mechanical scanning device²⁵, of BLI²⁶. De meeste van deze ontwerpen zijn “top-down” systemen waarbij de transducer bovenop het hoofd van het dier wordt geplaatst, met het dier in een natuurlijke positie. De ”top-down” workflow bestaat uit een waterbad^22,25,26 of een met water gevulde kegel^21,24. Het voordeel van het gebruik van een transducer in een gesloten kegel is de compactere voetafdruk, kortere insteltijd en eenvoudige ontsmettingsmogelijkheden die de hele workflow vereenvoudigen.

De interactie van het akoestische veld met de microbubbels is drukafhankelijk en varieert van oscillaties met lage amplitude (stabiele cavitatie genoemd) tot voorbijgaande instorting van de bellen (inertial cavitatie genoemd)^27,28. Er is een vaste consensus dat ultrasound-BBBD een akoestische druk vereist die ver boven de stabiele cavitatiedrempel ligt om succesvolle BBBD te bereiken, maar onder de traagheids cavitatiedrempel, die over het algemeen geassocieerd wordt met vasculaire/neuronale schade²⁹. De meest voorkomende vorm van monitoring en controle is de analyse van het (back-)scattered akoestische signaal met behulp van passieve cavitatiedetectie (PCD), zoals voorgesteld door McDannold et al.¹². PCD baseert zich op de analyse van de Fourier spectra van microbubble emissiesignalen, waarbij de sterkte en het uiterlijk van stabiele cavitatie-kenmerken (harmonischen, subharmonica en ultraharmonica) en traagheids cavitatiemarkers (breedbandrespons) in realtime kunnen worden gemeten.

Een “one size fits all” PCD-analyse voor nauwkeurige drukregeling is gecompliceerd vanwege de polydispersiteit van de microbubbelformulering (de oscillatieamplitude hangt sterk af van de bubbeldiameter), de verschillen in bubble shell-eigenschappen tussen merken en de akoestische oscillatie, die sterk afhankelijk is van frequentie en druk^30,31,32. Als gevolg hiervan zijn veel verschillende PCD-detectieprotocollen voorgesteld, die zijn aangepast aan specifieke combinaties van al deze parameters en zijn gebruikt in verschillende toepassingsscenario’s (variërend van in vitro experimenten over protocollen voor kleine dieren tot PCD voor klinisch gebruik) voor robuuste cavitatiedetectie en zelfs voor retroactieve feedbackcontrole van de druk^{11,14,30,31,32,33,34,35}. Het PCD-protocol dat in het kader van deze studie wordt gebruikt, is rechtstreeks afgeleid van McDannold et al.¹² en bewaakt de harmonische emissie voor de aanwezigheid van stabiele cavitatie en breedbandgeluid voor traagheids cavitatiedetectie.

We hebben een beeldgestuurd neuronavigatie FUS-systeem ontwikkeld voor het transiënt openen van de BBB om de afgifte van geneesmiddelen in het parenchym van de hersenen te verhogen. Het systeem is gebaseerd op in de handel verkrijgbaar componenten en kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende beeldvormingsmodaliteiten, afhankelijk van de beschikbare beeldvormingstechnieken in de dierenfaciliteit. Omdat we een workflow met hoge doorvoer nodig hebben, hebben we ervoor gekozen om röntgenfoto’s en BLI te gebruiken voor beeldbegeleiding en behandelingsplanning. Tumorcellen getransduceerd met een fotoproteïne (bijv. luciferase) zijn geschikt voor BLI imaging²⁰. Na toediening van het fotoproteïnesubstraat kunnen tumorcellen in vivo worden gecontroleerd en kunnen tumorgroei en locatie worden bepaald^20,36. BLI is een goedkope beeldvormingsmodaliteit, het maakt het mogelijk om de tumorgroei in de loop van de tijd te volgen, het heeft snelle scantijden en het correleert goed met tumorgroei gemeten met MRI^36,37. We hebben ervoor gekozen om het waterbad te vervangen door een met water gevulde kegel die aan de transducer is bevestigd om flexibiliteit mogelijk te maken om het platform waarop het knaagdier is gemonteerd vrij te verplaatsen^8,24. Het ontwerp is gebaseerd op een afneembaar platform dat is uitgerust met integratie van (I) stereotactisch platform voor kleine dieren (II) fiducial markers met zowel röntgen- als optische beeldcompatibiliteit (III) snel-afneembare anesthesiemasker en (IV) geïntegreerd temperatuurgeregeld dierverwarmingssysteem. Na de eerste inductie van anesthesie wordt het dier in een precieze positie op het platform gemonteerd waar het tijdens de hele procedure blijft. Bijgevolg passeert het hele platform alle stations van de workflow van de hele interventie, met behoud van een nauwkeurige en reproduceerbare positionering en aanhoudende anesthesie. De besturingssoftware maakt de automatische detectie van de fiducial markers mogelijk en registreert automatisch alle soorten beelden en beeldmodaliteiten (d.w.z. micro-CT, röntgen, BLI en fluorescentiebeeldvorming) in het referentiekader van het stereotactische platform. Met behulp van een automatische kalibratieprocedure is de brandpuntsafstand van de ultrasone transducer precies bekend binnenin, wat de automatische fusie van interventionele planning, akoestische levering en follow-up beeldvormingsanalyse mogelijk maakt. Zoals weergegeven in figuur 1 en figuur 2,biedt deze opstelling een hoge mate van flexibiliteit om specifieke experimentele workflows te ontwerpen en maakt het mogelijk om het dier op verschillende stations met elkaar te behandelen, wat op zijn beurt experimenten met hoge doorvoer vergemakkelijkt. We hebben deze techniek gebruikt voor succesvolle medicijnafgifte bij muis xenografts van hoogwaardig glioom zoals diffuus midline glioom.