A عالية الإنتاجية صورة موجهة الخلايا العصبية المجسمة ونظام الموجات فوق الصوتية مركزة لفتح حاجز الدم في الدماغ القوارض

حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو عقبة رئيسية لتسليم المخدرات في الدماغ parenchyma. معظم الأدوية العلاجية التي تم تطويرها لا تعبر BBB بسبب المعلمات الفيزيائية الكيميائية (على سبيل المثال ، الليبوفيليك ، الوزن الجزيئي ، متقبلي سندات الهيدروجين والمتبرعين) أو لا يتم الاحتفاظ بها بسبب تقاربها مع ناقلات efflux في الدماغ^1،2. مجموعة صغيرة من الأدوية التي يمكن أن تعبر BBB وعادة ما تكون جزيئات الدهون الصغيرة، والتي هي فعالة فقط في عدد محدود من أمراض الدماغ^1،2. ونتيجة لذلك ، بالنسبة لغالبية أمراض الدماغ ، تكون خيارات العلاج الدوائي محدودة وهناك حاجة إلى استراتيجيات جديدة لتوصيل الأدوية^3و4.

الموجات فوق الصوتية العلاجية هي تقنية ناشئة يمكن استخدامها لتطبيقات عصبية مختلفة مثل اضطراب BBB (BBBD) ، والتحوير العصبي ، والاجتثاث^4،5،6،7. من أجل تحقيق فتح BBB مع باعث الموجات فوق الصوتية خارج الجسم من خلال الجمجمة ، يتم الجمع بين الموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) مع الفقاعات الدقيقة. Microbubble بوساطة FUS النتائج في زيادة التوافر البيولوجي للأدوية في الدماغ parenchyma^5,8,9. في وجود موجات صوتية ، تبدأ الفقاعات الدقيقة في التذبذب لبدء التحول الخلوي وتعطيل التقاطعات الضيقة بين الخلايا البطانية ل BBB ، مما يتيح النقل شبه الخلوي للجزيئات الأكبر^10. أكدت الدراسات السابقة العلاقة بين كثافة الانبعاثات الصوتية والتأثير البيولوجي على فتح BBB^{11و12و13و14}. وقد تم بالفعل استخدام FUS بالاشتراك مع microbubbles في التجارب السريرية لعلاج الورم الأرومي الدبقي باستخدام تيموزولوميد أو دوكسوروبيسين الليبوسومال كعامل العلاج الكيميائي، أو لعلاج مرض الزهايمر والتصلب الجانبي الضموري^5،9،15،16.

منذ الموجات فوق الصوتية بوساطة BBB فتح النتائج في إمكانيات جديدة تماما للعلاج الدوائي، وهناك حاجة إلى البحوث قبل السريرية للترجمة السريرية لتقييم استجابة العلاج من المرشحين المخدرات مختارة. وهذا يتطلب عادة سير عمل عالي الإنتاجية بدقة مكانية عالية ويفضل أن يكون اكتشافا متكاملا للتجويف لرصد فتحة BBB المستهدفة مع إمكانية إعادة إنتاج عالية. وإذا أمكن، يجب أن تكون هذه النظم فعالة من حيث التكلفة في كل من الاستثمار الأولي وتكاليف التشغيل لكي تكون قابلة للتوسع وفقا لحجم الدراسة. يتم الجمع بين معظم أنظمة FUS قبل السريرية مع التصوير بالرنين المغناطيسي لتوجيه الصور وتخطيط العلاج^{15و17و18و19}. على الرغم من أن التصوير بالرنين المغناطيسي يعطي معلومات مفصلة عن تشريح الورم وحجمه ، إلا أنه تقنية مكلفة ، والتي يتم إجراؤها بشكل عام من قبل المشغلين المدربين / المهرة. بالإضافة إلى ذلك، قد لا يكون التصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة متاحا دائما للباحثين في المرافق قبل السريرية ويتطلب أوقات مسح طويلة لكل حيوان، مما يجعله أقل ملاءمة للدراسات الدوائية عالية الإنتاجية. الجدير بالذكر أنه بالنسبة للبحوث ما قبل السريرية في مجال الأورام العصبية ، ولا سيما نماذج الأورام المتسللة ، فإن إمكانية تصور الورم واستهدافه أمر ضروري لنجاح العلاج^20. حاليا، يتم استيفاء هذا الشرط فقط عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي أو عن طريق الأورام التي يتم تحويلها مع فوتوبروتين، وتمكين التصور مع التصوير الإضاءة الحيوية (BLI) في تركيبة مع إدارة الركيزة فوتوبروتين.

غالبا ما تستخدم أنظمة FUS الموجهة بالرنين المغناطيسي حماما مائيا لضمان انتشار الموجات فوق الصوتية للتطبيقات عبر الجمجمة ، حيث يتم غمر رأس الحيوان جزئيا في الماء ، ما يسمى بأنظمة “من أسفل إلى أعلى”^15و17و18. في حين أن هذه التصاميم تعمل بشكل جيد بشكل عام في الدراسات الحيوانية الصغيرة ، إلا أنها حل وسط بين أوقات إعداد الحيوانات وقابلية النقل والمعايير الصحية القابلة للحفاظ عليها واقعيا أثناء الاستخدام. كبديل للتصوير بالرنين المغناطيسي، طرق التوجيه الأخرى للملاحة المجسمة تشمل استخدام أطلس تشريحي القوارض^21،22،23، مؤشر ليزر ساعد الرؤية البصرية²⁴، جهاز المسح الميكانيكي بمساعدة الثقب²⁵، أو BLI²⁶. معظم هذه التصاميم هي أنظمة “من أعلى إلى أسفل” يتم فيها وضع المحول فوق رأس الحيوان ، مع وجود الحيوان في وضع طبيعي. يتكون سير عمل ”من أعلى إلى أسفل’ إما من حمام مائي^22،25،26 أو مخروط مملوء بالمياه^21،24. الفائدة من استخدام محول داخل مخروط مغلق هو بصمة أكثر إحكاما، وأقصر وقت الإعداد وإمكانيات إزالة التلوث على التوالي إلى الأمام تبسيط سير العمل بأكمله.

التفاعل بين المجال الصوتي مع microbubbles يعتمد على الضغط ويتراوح من التذبذبات منخفضة السعة (يشار إليها باسم التجويف مستقرة) لانهيار فقاعة عابرة (يشار إليها باسم التجويف القصور الذاتي)^27،28. هناك إجماع راسخ على أن الموجات فوق الصوتية BBBD يتطلب ضغطا صوتيا أعلى بكثير من عتبة التجويف المستقرة لتحقيق BBBD ناجح ، ولكن تحت عتبة التجويف القصور الذاتي ، والتي ترتبط بشكل عام بتلف الأوعية الدموية / الخلايا العصبية²⁹. الشكل الأكثر شيوعا للرصد والتحكم هو تحليل الإشارة الصوتية المتناثرة (الخلفية) باستخدام الكشف عن التجويف السلبي (PCD) ، كما اقترح McDannold^{وآخرون.} يعتمد PCD على تحليل أطياف فورييه لإشارات انبعاث الفقاعات الدقيقة ، والتي يمكن فيها قياس قوة ومظهر السمات المميزة المستقرة للتجاويف (التوافقيات ، و subharmonics ، و ultraharmonics) وعلامات التجويف القصور الذاتي (استجابة النطاق العريض) في الوقت الفعلي.

“مقاس واحد يناسب الجميع” PCD تحليل للتحكم الدقيق في الضغط معقد بسبب تعدد أضلاع صياغة microbubble (سعة التذبذب يعتمد بقوة على قطر الفقاعة) ، والاختلافات في خصائص قذيفة فقاعة بين العلامات التجارية ، والتذبذب الصوتي ، والذي يعتمد بقوة على التردد والضغط^30،31،32. ونتيجة لذلك، تم اقتراح العديد من بروتوكولات الكشف عن ثنائي الفينيل متعدد الكلور المختلفة، والتي تم تكييفها مع مجموعات معينة من كل هذه المعلمات واستخدمت في سيناريوهات تطبيق مختلفة (تتراوح بين التجارب في المختبر على بروتوكولات الحيوانات الصغيرة لPCD للاستخدام السريري) للكشف عن التجويف قوية وحتى للسيطرة على ردود الفعل بأثر رجعي من الضغط^{11،14،30،31،32،33،34،35}. 10- ويستمد بروتوكول ثنائي الفينيل متعدد الكلور المستخدم في نطاق هذه الدراسة مباشرة من McDannold et al.^12، ويرصد الانبعاثات التوافقية لوجود التجويف المستقر وضوضاء النطاق العريض للكشف عن التجويف القصور الذاتي.

لقد طورنا نظام FUS للخلايا العصبية الموجهة بالصور لفتح عابر ل BBB لزيادة تسليم الدواء إلى بارنشيما الدماغ. ويستند النظام إلى المكونات المتاحة تجاريا ويمكن تكييفه بسهولة مع عدة طرائق تصوير مختلفة، اعتمادا على تقنيات التصوير المتاحة في المرفق الحيواني. نظرا لأننا نحتاج إلى سير عمل عالي الإنتاجية ، فقد اخترنا استخدام الأشعة السينية وBLI لتوجيه الصور وتخطيط العلاج. الخلايا السرطانية التي يتم تحويلها باستخدام بروتين ضوئي (على سبيل المثال، لوسيفيراز) مناسبة لتصوير BLI²⁰. بعد إدارة الركيزة فوتوبروتين, يمكن رصد الخلايا السرطانية في الجسم الحي ونمو الورم ويمكن تحديد موقع^20,36. BLI هو وسيلة تصوير منخفضة التكلفة ، فإنه يمكن من متابعة نمو الورم مع مرور الوقت ، ولديه أوقات مسح سريع ويرتبط بشكل جيد مع نمو الورم مقاسا بالرنين المغناطيسي^36،37. لقد اخترنا استبدال حمام الماء بمخروط مملوء بالماء متصل بالمحول لتمكين المرونة من تحريك المنصة التي يتم تركيب القوارض عليها بحرية^8،24. ويستند التصميم على منصة قابلة للفصل مجهزة بدمج (I) منصة مجسمة للحيوانات الصغيرة (II) علامات fiducial مع كل من الأشعة السينية وتوافق الصور البصرية (III) قناع التخدير السريع القابل للفصل ، و (IV) نظام تسخين الحيوانات المتكامل المنظم لدرجة الحرارة. بعد التعريفي الأولي للتخدير ، يتم تركيب الحيوان في وضع دقيق على المنصة حيث يبقى أثناء الإجراء بأكمله. وبالتالي ، فإن المنصة بأكملها تمر بجميع محطات سير العمل للتدخل بأكمله ، مع الحفاظ على تحديد موقع دقيق وقابل للاستنساخ وتخدير مستدام. يسمح برنامج التحكم بالكشف التلقائي للعلامات الفقهية ويسجل تلقائيا جميع أنواع الصور وطرائق الصورة (أي التصوير المقطعي الدقيق والأشعة السينية والتصوير ببلي والتصوير الفلوري) في إطار مرجعي للمنصة المجسمة. بمساعدة إجراء المعايرة التلقائية ، يعرف الطول البؤري لمحول الموجات فوق الصوتية بدقة داخله ، مما يتيح الانصهار التلقائي للتخطيط التدخلي والتسليم الصوتي وتحليل التصوير المتابعة. كما هو مبين في الشكل 1 والشكل 2، يوفر هذا الإعداد درجة عالية من المرونة لتصميم سير عمل تجريبي مخصص ويسمح بالتعامل مع الحيوان في محطات مختلفة ، مما يسهل بدوره التجارب عالية الإنتاجية. لقد استخدمنا هذه التقنية لتسليم المخدرات الناجحة في xenografts الماوس من الورم الدبقي عالية الجودة مثل الورم الدبقي خط الوسط المنتشر.