Metabolik Yol Bilgilerinin GWAS Analizleri için Bir Pathway Association Çalışma Aracı

1. Kurulum Henüz yüklenmemişse R’yi yükleyin.NOT: PAST R ile yazılmıştır ve bu nedenle kullanıcılarının R yüklü olduğunu gerektirir. Bu yazının yazıldığı sırada, PAST’ı doğrudan Bioconductor’dan yüklemek R4.0 gerektirir.  PAST’in eski sürümleri R3.6 için Bioconductor’dan, PAST ise R3.5’li kullanıcılar için Github’dan yüklenebilir. R kurulum talimatları aşağıdaki bağlantıdan indirilebilir: https://www.r-project.org/. RStudio Desktop’ın en son sürümünü yükleyin veya RStudio’yu güncelleyin (isteğe bağlı).NOT: RStudio, R diliyle çalışmak için yararlı bir ortamdır. Kurulumu, özellikle PARLAK GUI uygulaması yerine komut satırında PAST çalıştırmayı seçenler için önerilir. RStudio ve kurulum talimatları aşağıdaki bağlantıda bulunabilir: https://rstudio.com/products/rstudio/. Bioconductor11’den PAST’ı Biyoikondüktör ile ilgili talimatları izleyerek yükleyin.NOT: Bioconductor aracılığıyla kurulum, PAST’in bağımlılıklarının yüklenmesini işlemelidir. Ayrıca, PAST Github12′ den yüklenebilir, ancak Github’dan yüklemek bağımlılıkları otomatik olarak yüklemez. PAST Shiny’yi yükleyin (isteğe bağlı). “app” dosyasını indirin. R” github deposunun Sürümler sayfasından: https://github.com/IGBB/PAST/releases/ ve indirilen dosyanın nerede olduğunu unutmayın.NOT: PAST, yöntemlerini doğrudan R ile çağırarak kullanılabilir, ancak R’ye daha az aşina olan kullanıcılar, rehberli bir kullanıcı arabirimi sağlayan PAST Shiny uygulamasını çalıştırabilir. PAST Shiny, PAST Github deposunun shiny_app dalında bulunan bir R komut dosyasıdır. PAST Shiny ilk çalıştırma sırasında bağımlılıklarını yüklemeye çalışacaktır. Uygulamayı aşağıda açıklanan üç yoldan biriyle başlatarak analize başlayın. RStudio ile PAST Parlak RStudio’yu kullanarak, uygulamanın bulunduğu klasörde yeni bir proje oluşturun. R bulunur. Dosya |’nı tıklatın Yeni Proje ve bu klasörü seçin. Yeni bir proje oluşturulduktan sonra uygulamayı açın. R dosyası daha önce indirildi. RStudio bu uygulamayı tanır. R parlak bir uygulamadır ve görüntülenen kaynak kodunun üstündeki çubukta bir Uygulama Çalıştır düğmesi oluşturur. Uygulamayı Çalıştır ‘ıtıklatın. RStudio daha sonra PAST Shiny uygulamasını görüntüleyen bir pencere başlatacak. R Konsollu PAST Shiny R’yi başlatın ve PAST Shiny uygulamasını başlatmak için aşağıdaki kodu çalıştırın: shiny::runApp(‘yol/klasör/ile/parlak/uygulama. R’. Tırnak işaretleri metnini uygulamanın bulunduğu klasörle değiştirin. R indirildi ve alıntılar sakla. R Shiny olmadan GEÇMİş PAST’i yüklemek için R Console’da kitaplığı (PAST) çalıştırın. 2. Parlak analizi özelleştirin (isteğe bağlı) Analiz başlığını “Yeni Analiz”den, birden çok analizin izlenmesine yardımcı olan çalıştırılma türünü daha iyi yansıtan bir şeyle değiştirin (bkz. Şekil 1). Şekil 1. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Çekirdek sayısını ve modu değiştirin. Çekirdek sayısını makinedeki toplam sayıyla 1 arasında herhangi bir sayıya ayarlayın, ancak GEÇMIŞ’e daha fazla kaynak ayırmanın makinedeki diğer işlemleri yavaşlatabileceğini unutmayın. Modu bölüm 6’daki açıklamaya göre ayarlayın. 3. GWAS verilerini yükleyin NOT: GWAS verilerinin sekmeyle sınırlandırılmış olduğunu doğrulayın. İlişkilendirme dosyasının aşağıdaki sütunları içerdiğinden emin olun: özellik, işaret adı, lokus veya kromozom, kromozom üzerindeki konum, p değeri ve işaretleyici için R2 değeri. Efekt dosyasının aşağıdaki sütunları içerdiğinden emin olun: özellik, işaret adı, locus veya kromozom, kromozom üzerindeki konum ve efekt. Kullanıcı verileri yüklerken sütunların adlarını belirtebileceğinden, bu sütunların sırası önemli değildir. Ek sütunlar yoksayılır. TASSEL13 bu dosyaları üretmek için kullanılabilir. GWAS verilerini PAST Shiny ile yükleyin. İlişkilendirme Dosyası ve Efekt dosyası seçim kutularını kullanarak bir ilişkilendirlik dosyası ve efekt dosyası seçin. Dosya seçim kutularının altındaki İlişkilendirme Sütunu Adı ve Efekt Sütunları Adı giriş kutularındaki sütun adlarını verilerdeki sütun adlarını yansıtacak şekilde değiştirin. Şekil 2. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. GWAS verilerini R Konsolu’na PAST ile yükleyin. Aşağıdaki kodu değiştirin ve çalıştırın:gwas_data = load_GWAS_data(“yol/association_file.tsv”, “yol/yol/effects_file.tsv”, association_columns = c(“Özellik”, “İşaretçi”, “Locus”, “Site”, “p”, “marker_R2”), effects_columns = c(“Özellik”, “İşaretçi”, “Locus”, “Site”, “Efekt”) NOT: GWAS dosyalarının gerçek konumunun yollarını değiştirin. association_columns ve effects_columns için sağlanan değerler varsayılan değerlerdir. Adlar varsayılan değerlerle eşleşmezse, sütun adlarını belirtin. Aksi takdirde, bunlar atlanabilir. 4. Yük bağlantı dengesi (LD) verileri NOT: Bağlantı dengesi (LD) verilerinin sekmeyle sınırlandırılmış olduğunu ve aşağıdaki veri türlerini içerdiğini doğrulayın: Locus, Position1, Site1, Position2, Site2, Position1 ve Position2 arasındaki temel çiftler halinde mesafe ve R2 değeri. LD verilerini PAST Shiny ile yükleyin. LD verilerini içeren dosyayı seçin. Gerekirse, dosya seçim kutusunun altındaki LD Sütun Adları giriş kutularındaki sütun adlarını LD verilerindeki sütun adlarıyla eşleşecek şekilde değiştirin. Şekil 3. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. R Konsolu’na GEÇMIŞle LD Verileri Yükleyin. LD verilerini yüklemek için aşağıdaki kodu değiştirin ve çalıştırın:LD = load_LD(“yol//LD.tsv”, LD_columns = c(“Locus1”, “Konum1”, “Site1”, “Konum2”, “Site2”, “Dist_bp”, “R.2”)NOT: Yolu LD dosyasının gerçek konumuna değiştirin. LD_columns için sağlanan değerler varsayılan değerlerdir. Adlar bu varsayılanlarla eşleşmezse, sütunların doğru adlarını belirtin; aksi takdirde, bunlar atlanabilir. 5. Genlere SNP’ler atayın NOT: Ek açıklamaları GFF biçiminde indirin veya başka bir şekilde bulun. Bu ek açıklamalar genellikle belirli organizmalar için çevrimiçi veritabanlarında bulunabilir. Ek açıklamalar verilerinin kalitesi yol analizinin kalitesini etkileyeceğinden, düşük kaliteli ek açıklamalar konusunda dikkatli olun. Bu ek açıklamaların ilk sütununun (kromozom) ilişkilendirilmez, efektler ve LD verilerindeki locus/kromozomun biçimiyle eşleştiğini onaylayın. Örneğin, GWAS ve LD veri dosyaları ilk kromozomu “1” olarak adlandırıyorsa, ek açıklamalar ilk kromozomu “chr1” olarak adlandırmamalıdır. PAST Shiny ile genlere SNP’ler atayın.NOT: Uygun bir R2 kesmesinin belirlenmesi hakkında daha fazla bilgi Tang ve ark.6’da , “YOL analizi için SNP’den gen algoritmasına” adlı bölümde bulunabilir. GFF ek açıklamalarını içeren dosyayı seçin. Hangi pencere boyutunun ve R2 kesmesinin düşünülen türler için en uygun olduğunu düşünün ve varsayılanlar yüklenen verilere uymuyorsa değiştirin.NOT: PAST’deki varsayılan değerler öncelikle mısır için uygun değerleri yansıtır. Bu adımda, GEÇMİş Parlak analizin başında ayarlanan çekirdek sayısı (Adım 2.2) kullanılır. Şekil 4. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. R Konsolu’nda GEÇMIŞ olan genlere SNP’ler atayın. Genlere SNP atamak için aşağıdaki kodu değiştirin ve çalıştırın:gen = assign_SNPs_to_genes(gwas_data, LD, “yol/anotations.gff”, c(“gen”), 1000, 0,8, 2)NOT: Bu örnek kodda, birkaç varsayılan öneri sağlanır: 1000, genleri aramak için SNP’nin etrafındaki pencerenin boyutudur; 0.8, R2için kesme değeridir; 2, paralel işleme için kullanılan çekirdek sayısıdır. Ek açıklamaların yolu da ek açıklamalar dosyasının gerçek konumuna değiştirilmelidir. 6. Önemli yolları keşfedin NOT: Pathways dosyasının, her yoldaki her gen için bir satırla birlikte sekmeyle ayrılmış biçimde aşağıdaki verileri içerdiğini doğrulayın: yol kimliği – “PWY-6475-1” gibi bir tanımlayıcı; yol açıklaması – yolların “trans-likopen biyosentezi” gibi ne yaptığının daha uzun bir açıklaması; gen – ek açıklamalarda verilen isimlerle eşleşmesi gereken yoldaki bir gen. Yol bilgileri büyük olasılıkla MaizeGDB gibi belirli organizmalar için çevrimiçi veritabanlarında bulunabilir. Kullanıcı tarafından belirtilen ikinci seçenek moddur. “Artan”, verim gibi ölçülen özelliğin artan bir değeri istendiğinde yansıtan fenotipleri ifade ederken, “azalan”, böcek hasar derecelendirmeleri gibi ölçülen değerlerde bir düşüşün faydalı olduğu bir özelliği ifade eder. Yolların önemi daha önce açıklananyöntemler 4, 6,14kullanılarak test edilir. PAST Shiny ile önemli yolları keşfedin. Yol verilerini içeren dosyayı seçin ve çözümleme seçeneklerinde modun seçili olduğundan emin olun. Gerekirse, analiz için onu korumak için bir yolda olması gereken genlerin sayısını ve etkinin önemini test etmek için boş dağılımı oluşturmak için kullanılan permütasyonların sayısını değiştirin. Şekil 5. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. NOT: Bu adımda, GEÇMIŞ Parlak analizinin (Adım 2.2) başında ayarlanan çekirdek sayısı ve mod kullanılır. Varsayılan gen sayısı şu anda 5 gen olarak belirlenmiştir, bu nedenle daha az bilinen genlere sahip yollar çıkarılacaktır. Kullanıcı, daha kısa yollar eklemek için bu değeri 4 veya 3’e düşürebilir, ancak bunu yapmak yanlış olumlu sonuçlar riskiyle karşı karşıya kalacaktır. Bu değerin artırılması analizin gücünü artırabilir, ancak analizden daha fazla yol kaldıracaktır. Kullanılan permütasyon sayısını değiştirmek testin gücünü arttırır ve azaltır. R Console’da PAST ile önemli yolları keşfedin. Önemli yolları bulmak için aşağıdaki kodu değiştirin ve çalıştırın:rugplots_data <- find_pathway_significance(genler, "yol/yol/yollar.tsv", 5, "artan", 1000, 2)NOT: Bu örnek kodda, önerilen birkaç varsayılan değer sağlanır. 5, yolu analizde tutmak için bir yolda olması gereken minimum gen sayısıdır, artan ölçülen özelliğin artan bir miktarını ifade eder (kullanıcının özellikten bağımsız olarak hem artan hem de azalan çalışması önerilir; veri yorumlama ikisi için farklılık gösterir, ancak), 1000, boş dağılımı belirlemek için etkileri örnekleme sayısıdır, ve 2 paralel işleme için kullanılan çekirdek sayısıdır. Yolu, yollar dosyasının gerçek konumuna değiştirin. 7. Rugplots’ı Görüntüleyin PAST Parlak ile Rugplots görüntüleyin. Tüm girişler yüklendikten ve ayarlandıktan sonra Analize Başla ‘yıtıklatın. Bir ilerleme çubuğu görüntülenir ve analizin en son hangi adımının tamamlandığını gösterir. Analiz tamamlandığında, PAST Shiny Sonuçlar sekmesine geçer. Sol sütunda bir sonuç tablosu (“yollar” olarak etiketlenmiştir) ve Rugplots sağ sütunda (“çizimler” olarak etiketlenmiş) görüntülenir. Filtreleme parametrelerini denetlemek için kaydırıcıyı kullanın. Filtreleme düzeyi tatmin edici olduğunda, tüm görüntüleri ve tabloları analiz başlığıyla adlandırılan bir ZIP dosyasına tek tek indirmek için sol alttaki Sonuçları İndir düğmesini tıklatın. Bu ZIP dosyası filtre uygulanmış tabloyu, filtrelenmemiş tabloyu ve filtre uygulanmış tablodaki yol başına bir görüntü içerir. Şekil 6. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. R Konsolunda GEÇMIŞle Rugplots’ı Görüntüleme Sonuçları kaydetmek için aşağıdaki kodu değiştirin ve çalıştırın:plot_pathways(rugplots_data, “pvalue”, 0,02, “artan”, “output_folder”)NOT: Bu örnek kodda, önerilen birkaç varsayılan değer sağlanır. pvalue, kullanıcı tarafından bir önem eşiği seçildikten sonra önemsiz yolları filtrelemek için kullanılabilecek verileri sağlar; 0.02, filtrelemede kullanılan varsayılan değerdir ve artan, ölçülen özelliğin artan bir miktarını ifade eder (kullanıcının özelliğinden bağımsız olarak hem artan hem de azalan çalışması önerilir; veri yorumlama ikisi için farklılık gösterecektir); output_folder, görüntülerin ve tabloların yazılacağı klasördür (bu klasör işlevi çalıştırmadan önce bulunmalıdır). Filtre uygulanmış sonuçlar, filtre uygulanmamış sonuçlar ve filtre uygulanmış sonuçlardaki her yol için tek tek görüntüler tablosu bu klasöre yazılır.