Ein Pathway Association Study Tool für GWAS-Analysen von Stoffwechselweginformationen

1. Einrichtung Installieren Sie R, falls es noch nicht installiert ist.HINWEIS: PAST ist in R geschrieben und erfordert daher, dass seine Benutzer R installiert haben. Zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels erfordert die Installation von PAST direkt von Bioconductor R4.0.  Ältere Versionen von PAST können von Bioconductor für R3.6 installiert werden, und PAST kann von Github für Benutzer mit R3.5 installiert werden. Die R-Installationsanleitung kann unter folgendem Link heruntergeladen werden: https://www.r-project.org/. Installieren Sie die neueste Version von RStudio Desktop oder aktualisieren Sie RStudio (optional).HINWEIS: RStudio ist eine hilfreiche Umgebung für die Arbeit mit der Sprache R. Die Installation wird empfohlen, insbesondere für diejenigen, die PAST in der Befehlszeile und nicht über die Shiny GUI-Anwendung ausführen möchten. RStudio und seine Installationsanleitung finden Sie unter folgendem Link: https://rstudio.com/products/rstudio/. Installieren Sie PAST von Bioconductor11, indem Sie den Anweisungen auf Bioconductor folgen.HINWEIS: Die Installation über Bioconductor sollte die Installation der Abhängigkeiten von PAST übernehmen. Darüber hinaus kann PAST von Github12installiert werden, aber die Installation von Github installiert Abhängigkeiten nicht automatisch. Installieren Sie PAST Shiny (optional). Laden Sie die Datei “app. R” von der Seite “Releases” des Github-Repositorys: https://github.com/IGBB/PAST/releases/ und merken Sie sich, wo sich die heruntergeladene Datei befindet.HINWEIS: PAST kann verwendet werden, indem seine Methoden direkt mit R aufruft werden, aber Benutzer, die mit R weniger vertraut sind, können die Past Shiny-Anwendung ausführen, die eine geführte Benutzeroberfläche bereitstellt. PAST Shiny ist ein R-Skript, das im shiny_app Zweig des PAST Github-Repositorys verfügbar ist. PAST Shiny versucht, seine Abhängigkeiten während der ersten Ausführung zu installieren. Beginnen Sie die Analyse, indem Sie die Anwendung auf eine der drei unten beschriebenen Arten starten. PAST Shiny mit RStudio Erstellen Sie mit RStudio ein neues Projekt in dem Ordner, in dem sich die App befindet. R befindet sich. Klicken Sie auf Datei | Neues Projekt und wählen Sie diesen Ordner aus. Sobald ein neues Projekt erstellt wurde, öffnen Sie die App. R-Datei, die zuvor heruntergeladen wurde. RStudio erkennt diese App. R ist eine Shiny-App und erstellt eine Schaltfläche App ausführen auf der Leiste über dem angezeigten Quellcode. Klicken Sie auf App ausführen. RStudio öffnet dann ein Fenster, in dem die Anwendung PAST Shiny angezeigt wird. PAST Shiny mit R-Konsole Starten Sie R und führen Sie den folgenden Code aus, um die PAST Shiny-Anwendung zu starten: shiny::runApp(‘path/to/folder/with/shiny/app. R”. Ersetzen Sie den Text in Anführungszeichen durch den Ordner, in dem die App angezeigt wird. R wurde heruntergeladen und behalten Sie die Zitate. PAST ohne R Shiny Führen Sie library(PAST) in einer R-Konsole aus, um PAST zu laden. 2. Shiny-Analyse anpassen (optional) Ändern Sie den Analysetitel von “Neue Analyse” in etwas, das die Art der ausgeführten Analyse besser widerspiegelt, was dazu beiträgt, den Überblick über mehrere Analysen zu behalten (siehe Abbildung 1). Abbildung 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ändern Sie die Anzahl der Kerne und den Modus. Legen Sie die Anzahl der Kerne auf eine beliebige Zahl zwischen 1 und der Gesamtzahl auf dem Computer fest, aber beachten Sie, dass die Zuweisen weiterer Ressourcen für PAST andere Vorgänge auf dem Computer verlangsamen kann. Legen Sie den Modus basierend auf der Beschreibung in Abschnitt 6 fest. 3. GWAS-Daten laden HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die GWAS-Daten tabulatorgetrennt sind. Stellen Sie sicher, dass die Assoziationsdatei die folgenden Spalten enthält: Merkmal, Markername, Locus oder Chromosom, Position auf dem Chromosom, p-Wert undR2-Wert für den Marker. Stellen Sie sicher, dass die Effektdatei die folgenden Spalten enthält: Merkmal, Markername, Ort oder Chromosom, Position auf dem Chromosom und Effekt. Die Reihenfolge dieser Spalten ist nicht wichtig, da der Benutzer beim Laden der Daten die Namen der Spalten angeben kann. Alle zusätzlichen Spalten werden ignoriert. Tassel13 kann verwendet werden, um diese Dateien zu erzeugen. Laden Sie GWAS-Daten mit PAST Shiny. Wählen Sie eine Assoziationsdatei und eine Effektdatei aus, indem Sie die Auswahlfelder Zuordnungsdatei und Effektdatei verwenden. Ändern Sie die Spaltennamen in den Eingabefeldern Spaltenname Zuordnen und Effektspaltenname unterhalb der Dateiauswahlfelder, um die Spaltennamen in den Daten widerzuspiegeln. Abbildung 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Laden Sie GWAS-Daten mit PAST in die R-Konsole. Ändern Sie den folgenden Code, und führen Sie ihn aus:gwas_data = load_GWAS_data(“path/to/association_file.tsv”, “path/to/effects_file.tsv”, association_columns = c(“Trait”, “Marker”, “Locus”, “Site”, “p”, “marker_R2”), effects_columns = c(“Trait”, “Marker”, “Locus”, “Site”, “Effect”) HINWEIS: Ändern Sie die Pfade zum tatsächlichen Speicherort der GWAS-Dateien. Die für association_columns und effects_columns angegebenen Werte sind die Standardwerte. Wenn die Namen nicht mit den Standardwerten übereinstimmen, geben Sie die Spaltennamen an. Andernfalls können diese weggelassen werden. 4. Lastverknüpfungs-Ungleichgewichtsdaten (LD) HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die LD-Daten (Linkage Disequilibrium) tabulatorgetrennt sind und die folgenden Datentypen enthalten: Locus, Position1, Site1, Position2, Site2, Abstand in Basispaaren zwischen Position1 und Position2 undR2-Wert. Laden Sie LD-Daten mit PAST Shiny. Wählen Sie die Datei aus, die LD-Daten enthält. Ändern Sie die Spaltennamen in den Eingabefeldern LD-Spaltennamen unterhalb des Dateiauswahlfelds so, dass sie bei Bedarf mit den Spaltennamen in den LD-Daten übereinstimmen. Abbildung 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Laden Sie LD-Daten mit PAST in die R-Konsole. Ändern Sie den folgenden Code, und führen Sie ihn aus, um LD-Daten zu laden:LD = load_LD(“path/to/LD.tsv”, LD_columns = c(“Locus1”, “Position1”, “Site1”, “Position2”, “Site2”, “Dist_bp”, “R.2”)HINWEIS: Ändern Sie den Pfad zum tatsächlichen Speicherort der LD-Datei. Die für LD_columns angegebenen Werte sind die Standardwerte. Wenn die Namen nicht mit diesen Standardwerten übereinstimmen, geben Sie die richtigen Namen der Spalten an. andernfalls können diese weggelassen werden. 5. Zuweisen von SNPs zu Genen HINWEIS: Laden Sie Anmerkungen im GFF-Format herunter oder suchen Sie sie anderweitig. Diese Anmerkungen sind oft in Online-Datenbanken für bestimmte Organismen zu finden. Seien Sie vorsichtig bei Anmerkungen von geringer Qualität, da die Qualität der Anmerkungsdaten die Qualität der Pfadanalyse beeinflusst. Vergewissern Sie sich, dass die erste Spalte dieser Anmerkungen (das Chromosom) mit dem Format des Locus/Chromosoms in den Assoziations-, Effekt- und LD-Daten übereinstimmt. Beispielsweise sollten die Anmerkungen das erste Chromosom nicht “chr1” nennen, wenn die GWAS- und LD-Datendateien das erste Chromosom “1” nennen. Weisen Sie SNPs Genen mit PAST Shiny zu.HINWEIS: Weitere Informationen zur Bestimmung eines geeignetenR2-Cutoffs finden Sie in Tang et al.6, im Abschnitt “SNP to gene algorithm for the pathway analysis”. Wählen Sie die Datei aus, die GFF-Anmerkungen enthält. Überlegen Sie, welche Fenstergröße und derR2-Cutoff für die betrachtete Art am besten geeignet sind, und ändern Sie sie, wenn die Standardwerte nicht zu den hochgeladenen Daten passen.HINWEIS: Die Standardwerte in PAST spiegeln in erster Linie werte wider, die für Mais geeignet sind. In diesem Schritt wird die Anzahl der Kerne verwendet, die zu Beginn der PAST Shiny-Analyse (Schritt 2.2) festgelegt wurden. Abbildung 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Weisen Sie Genen mit PAST in der R-Konsole SNPs zu. Ändern und führen Sie den folgenden Code aus, um Genen SNPs zuzuweisen:Gene = assign_SNPs_to_genes(gwas_data, LD, “path/to/annotations.gff”, c(“gene”), 1000, 0.8, 2)HINWEIS: In diesem Beispielcode werden mehrere Standardvorschläge bereitgestellt: 1000 ist die Größe des Fensters um den SNP, um nach Genen zu suchen; 0,8 ist der Grenzwert fürR2; 2 ist die Anzahl der Kerne, die für die parallele Verarbeitung verwendet werden. Der Pfad zu den Anmerkungen sollte auch in den tatsächlichen Speicherort der Anmerkungsdatei geändert werden. 6. Entdecken Sie wichtige Pfade HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Pathways-Datei die folgenden Daten im tabulatorgetrennten Format mit einer Zeile für jedes Gen in jedem Pathway enthält: Pathway ID – ein Bezeichner wie “PWY-6475-1”; Pfadbeschreibung – eine längere Beschreibung dessen, was die Wege tun, wie “Trans-Lycopin-Biosynthese”; Gen – ein Gen im Signalweg, das mit den in den Anmerkungen angegebenen Namen übereinstimmen sollte. Pathway-Informationen können wahrscheinlich in Online-Datenbanken für bestimmte Organismen wie MaizeGDB gefunden werden. Die zweite vom Benutzer angegebene Option ist der Modus. “Zunehmend” bezieht sich auf Phänotypen, die widerspiegeln, wann ein steigender Wert des gemessenen Merkmals wünschenswert ist, wie z. B. Ertrag, während “abnehmend” sich auf ein Merkmal bezieht, bei dem eine Abnahme der gemessenen Werte von Vorteil ist, z. B. Insektenschadenswerte. Die Signifikanz von Signalwegen wird mit den zuvorbeschriebenenMethoden4,6,14getestet. Entdecken Sie bedeutende Wege mit PAST Shiny. Wählen Sie die Datei mit den Pfaddaten aus, und stellen Sie sicher, dass der Modus in den Analyseoptionen ausgewählt ist. Ändern Sie bei Bedarf die Anzahl der Gene, die sich in einem Signalweg befindet, um sie für die Analyse beizubehalten, und die Anzahl der Permutationen, die zum Erstellen der Nullverteilung verwendet werden, um die Signifikanz der Wirkung zu testen. Abbildung 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. HINWEIS: In diesem Schritt wird die Anzahl der Kerne und der Modus verwendet, der zu Beginn der PAST Shiny-Analyse (Schritt 2.2) eingestellt wurde. Die Standardanzahl der Gene ist derzeit auf 5 Gene festgelegt, so dass Wege mit weniger bekannten Genen entfernt werden. Der Benutzer kann diesen Wert auf 4 oder 3 senken, um kürzere Pfade einzubeziehen, aber dadurch werden falsch positive Ergebnisse riskiert. Die Erhöhung dieses Wertes kann die Leistungsfähigkeit der Analyse erhöhen, entfernt jedoch mehr Pfade aus der Analyse. Das Ändern der Anzahl der verwendeten Permutationen erhöht und verringert die Leistung des Tests. Entdecken Sie wichtige Pfade mit PAST in der R Console. Ändern Sie den folgenden Code, und führen Sie ihn aus, um wichtige Pfade zu ermitteln:rugplots_data <- find_pathway_significance(Gene, "path/to/pathways.tsv", 5, "increasing", 1000, 2)HINWEIS: In diesem Beispielcode werden mehrere vorgeschlagene Standardwerte bereitgestellt. 5 ist die Mindestanzahl von Genen, die sich in einem Signalweg befindet, um den Signalweg in der Analyse zu halten, zunehmend bezieht sich auf eine zunehmende Menge des gemessenen Merkmals (es wird empfohlen, dass der Benutzer unabhängig vom Merkmal sowohl zunehmend als auch abnimmt; die Dateninterpretation unterscheidet sich jedoch für die beiden), 1000 ist die Anzahl der Male, um die Effekte zu untersuchen, um die Nullverteilung zu bestimmen, und 2 ist die Anzahl der Kerne, die für die parallele Verarbeitung verwendet werden. Ändern Sie den Pfad zum tatsächlichen Speicherort der Pfaddatei. 7. Rugplots ansehen Sehen Sie sich Rugplots mit PAST Shiny an. Nachdem alle Eingaben hochgeladen und festgelegt wurden, klicken Sie auf Analyse starten. Ein Fortschrittsbalken wird angezeigt und zeigt an, welcher Schritt der Analyse zuletzt abgeschlossen wurde. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, wechselt PAST Shiny zur Registerkarte Ergebnisse. In der linken Spalte wird eine Ergebnistabelle angezeigt (mit der Bezeichnung “Pathways”) und die Rugplots in der rechten Spalte (mit der Bezeichnung “plots”). Verwenden Sie den Schieberegler, um die Filterparameter zu steuern. Wenn die Filterstufe zufriedenstellend ist, klicken Sie unten links auf die Schaltfläche Ergebnisse herunterladen, um alle Bilder und Tabellen einzeln in eine ZIP-Datei herunterzuladen, die mit dem Analysetitel benannt ist. Diese ZIP-Datei enthält die gefilterte Tabelle, die ungefilterte Tabelle und ein Bild pro Pfad in der gefilterten Tabelle. Abbildung 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Rugplots mit PAST in der R-Konsole anzeigen Ändern Sie den folgenden Code, und führen Sie ihn aus, um die Ergebnisse zu speichern:plot_pathways(rugplots_data, “Pvalue”, 0,02, “steigend”, “output_folder”)HINWEIS: In diesem Beispielcode werden mehrere vorgeschlagene Standardwerte bereitgestellt. pvalue stellt die Daten bereit, die zum Filtern unbedeutender Pfade verwendet werden können, nachdem der Benutzer einen Signifikanzschwellenwert ausgewählt hat. 0,02 ist der Standardwert, der bei der Filterung verwendet wird, und erhöhen bezieht sich auf eine zunehmende Menge des gemessenen Merkmals (es wird empfohlen, dass der Benutzer unabhängig vom Merkmal sowohl zunehmend als auch abnehmend ausgeht; die Dateninterpretation unterscheidet sich jedoch für die beiden); output_folder ist der Ordner, in den die Bilder und Tabellen geschrieben werden (dieser Ordner muss vor dem Ausführen der Funktion vorhanden sein). Eine Tabelle mit gefilterten Ergebnissen, die ungefilterten Ergebnisse und einzelne Bilder für jeden Pfad in den gefilterten Ergebnissen werden in diesen Ordner geschrieben.