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Biology

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage demonstriert auf Medicago-Truncatula-Wurzeln bei 22 T

Published: January 16, 2021
doi:
10.3791/61266
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1Solid-state NMR, Leiden Institute of Chemistry, Faculty of Science,Leiden University, 2Laboratory of Biophysics,Wageningen University & Research, 3Laboratory of BioNanoTechnology,Wageningen University & Research, 4MAGNEtic resonance Facility,Wageningen University & Research, 5C.J. Gorter Center for High Field MRI, Radiology department, Leiden University Medical Centre,Leiden University, 6Institute for Medical Physics and Biophysics,Leipzig University

Summary

Ein Protokoll zur Untersuchung von biologischem Gewebe in hoher räumlicher Auflösung mittels ultrahochfeld-Magnetresonanzmikroskopie (MRM) mit Mikrospulen wird vorgestellt. Für die Charakterisierung der Mikrospulen werden Schritt-für-Schritt-Anleitungen bereitgestellt. Schließlich wird die Optimierung der Bildgebung an Pflanzenwurzeln demonstriert.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt ein Signal-Rausch-Verhältnis (SNR)-Kalibrierungs- und Probenvorbereitungsverfahren für sohlenförmige Mikrospulen in Kombination mit biologischen Proben, die für hochauflösende Magnetresonanztomographie (MRT) entwickelt wurden, auch als MR-Mikroskopie (MRM) bezeichnet. Es kann bei präklinischen MRT-Spektrometern verwendet werden, die an Medicago-Trunkatula-Wurzelproben nachgewiesenwerden. Mikrospulen erhöhen die Empfindlichkeit, indem sie die Größe des HF-Resonators an die Größe der interessensbestimmten Probe anpassen, wodurch höhere Bildauflösungen in einer bestimmten Datenerfassungszeit ermöglicht werden. Aufgrund des relativ einfachen Designs sind sohlende Mikrospulen einfach und kostengünstig zu konstruieren und können leicht an die Probenanforderungen angepasst werden. Systematisch erklären wir, wie neue oder selbst gebaute Mikrospulen mithilfe einer Referenzlösung kalibriert werden. Die Kalibrierungsschritte umfassen: Pulsleistungsbestimmung mittels einer Nutationskurve; Abschätzung der HF-Feldhomogenität; und Berechnung eines volumennormalisierten Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) unter Verwendung von Standardpulssequenzen. Wichtige Schritte bei der Probenvorbereitung für kleine biologische Proben werden ebenso diskutiert wie mögliche mildernde Faktoren wie magnetische Anfälligkeitsunterschiede. Die Anwendungen einer optimierten Magnetspule werden durch hochauflösende 3D-Bildgebungeiner Wurzelprobe (13 x 13 x 13 x 13 ,2,2 pL) demonstriert.

Introduction

Magnetresonanztomographie ist ein vielseitiges Werkzeug, um eine Vielzahl von biologischen Proben, vom Menschen bis zu einzelnen Zellen1,2,3, nicht-invasiv abzubilden. Während MRT-Scanner für medizinische Bildgebungsanwendungen in der Regel Magnete mit einer Feldstärke von 1,5 T bis 3 T verwenden, werden einzellige Anwendungen mit viel höheren Feldstärken1,3,4abgebildet. Die Untersuchung von Proben mit Auflösungen unter hundert Mikrometern wird als Magnetresonanzmikroskopie (MRM)5bezeichnet. MRM leidet jedoch unter einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zu anderen verfügbaren Mikroskopie- oder Bildgebungstechniken (z. B. optische Mikroskopie oder CT). Zur Optimierung von SNR6können mehrere Ansätze verfolgt werden. Ein Ansatz besteht darin, eine höhere Magnetfeldstärke zu verwenden, während ein komplementärer Ansatz darin besteht, den Signaldetektor für einzelne Proben zu optimieren. Für letztere sollten die Abmessungen des Detektors an die Abmessungen der von Interesse sindden Probe angepasst werden. Bei kleinen Proben mit einem Durchmesser von ≈0,5-2 mm (z. B. Wurzelgewebe) sind Mikrospulen nützlich, da der SNR umgekehrt proportional zum Spulendurchmesser6,7ist. Auflösungen von bis zu 7,8 x 7,8 x 15 xm 3 wurden auf tierischen Zellen mit speziellen Mikrospulen8erreicht. Es gibt eine Vielzahl von Mikrospulentypen, mit planaren und magnetoiden Spulen, die je nach Anwendung und Gewebegeometrie am häufigsten verwendet werden9. Planare Spulen haben eine hohe Empfindlichkeit in der Nähe ihrer Oberfläche, was für Anwendungen auf dünnen Scheiben nützlich ist. Beispielsweise wurde ein Verfahren beschrieben, das speziell für die Abbildung von durchgeflossenem Gewebe entwickelt wurde, um planare Mikrospulen10zu verwenden. Planare Spulen haben jedoch einen hohen Falloff der Empfindlichkeit und keine klar definierte Referenzpulsleistung. Magnetspulen, zylindrisch, haben einen größeren Anwendungsbereich und sind eher für dickere Proben bevorzugt. Hier beschreiben wir die Eigenschaften der Magnetspule, ein Protokoll zur Vorbereitung von Proben für Mikrospulen-MRT, sowie die Kalibrierung einer Magnetmikrospule (Abbildung 1A).

Die Magnetspule besteht aus einem leitenden Draht, der wie ein Korkenzieher um eine Kapillare gewickelt ist, die die Probe hält (Abbildung 1B). Mikrospulenbaugruppen können nur mit emailliertem Kupferdraht, einer Reihe von Kondensatoren und einer geeigneten Basis zum Löten der Komponenten hergestellt werden (Abbildung 1B). Die hauptwichtigsten Vorteile sind die Einfachheit und die niedrigen Kosten, kombiniert mit guten Leistungsmerkmalen in Bezug auf SNR pro Volumeneinheit und B1-Feldhomogenität. Die einfache Konstruktion ermöglicht eine schnelle Iteration von Spulenkonstruktionen und Geometrien. Die spezifischen Anforderungen an die Magnet-Mikrospulen-Konstruktion und Sondencharakterisierung (d.h. die Theorie der Elektronik, Werkbenchmessungen und Spektrometermessungen für eine Vielzahl von Spulengeometrien) wurden an anderer Stelle ausführlich beschrieben7,11,12,13,14.

Eine Magnetspule kann unter Berücksichtigung der Konstruktionsregeln für die gewünschten Abmessungen gemäß den an anderer Stelle beschriebenen Richtlinien15,16gebaut werden. In diesem speziellen Fall wurde eine Spule mit einem Innendurchmesser von 1,5 mm verwendet, hergestellt aus emailliertem Kupferdraht, 0,4 mm Durchmesser, um eine Kapillare von 1,5 mm Außendurchmesser geschlungen. Dieses Magnet wird auf einer Grundplatte gehalten, auf der eine Schaltung hergestellt wird, bestehend aus einem Tuningkondensator (2,5 pF), einem variablen passenden Kondensator (1,5-6 pF) sowie Kupfer-Verbindungsdrähten (Abbildung 1A, 1C). Der Tuning-Kondensator wird gewählt, um die gewünschte Resonanzfrequenz von 950 MHz zu erreichen, während der passende Kondensator gewählt wird, um die maximale Signalübertragung bei einer Impedanz von 50 Ohm zu erreichen. Der größere Kondensator ist variabel, um eine feinere Anpassung zu ermöglichen. Im regulären Betrieb werden Abstimmungen und Abgleich mit Kondensatoren in der Sondenbasis durchgeführt. Die montierte Mikrospule muss auf einer Sonde montiert werden, damit sie in den Magneten eingesetzt werden kann. Je nach System kann ein zusätzlicher Halter erforderlich sein. Hier verwenden wir eine 22,3-T-Magnetkombination mit einer Bruker Console Avance III HD in Kombination mit einer Micro5-Sonde. In diesem Fall haben wir einen modifizierten Stützeinsatz verwendet, der mit den notwendigen Anschlüssen ausgestattet ist, um eine Verbindung zum 1H-Kanal der Sonde herzustellen (Abbildung 1A).

Die auf die Anfälligkeit abgestimmte Konstruktion der Spule umfasst ein Reservoir mit perfluorierter Flüssigkeit, um Anfälligkeitsinkongruenzen zu verringern, die sich daraus ergeben, dass sich die Kupferspule in unmittelbarer Nähe zur Probe17befindet. Ein Reservoir wurde aus einer Plastikspritze hergestellt, um die Spule einzuschließen und mit Fomblin gefüllt. Da die perfluorierte Flüssigkeit die Spule umschließen muss, wird der verfügbare Durchmesser für eine Probe auf einen Außendurchmesser von 1 mm reduziert. Zur einfachen Probenänderung wurde die Probe in einer Kapillare mit einem Außendurchmesser von 1 mm und einem Innendurchmesser von 700 m hergestellt. Die notwendigen Werkzeuge für die Probenvorbereitung sind in Abbildung 2Adargestellt.

Grundlegende experimentelle MR-Parameter sind in hohem Maße von der Hardware des verwendeten Systems abhängig, einschließlich Gradientensystem, Feldstärke und Konsole. Zur Beschreibung der Systemleistung können mehrere Parameter verwendet werden, von denen 90° Pulslänge und -leistung,B1-Homogenitätund SNR pro Volumeneinheit (SNR/mm3) am praktischsten relevant sind. SNR/mm3 ist nützlich, um die Leistung verschiedener Spulen auf demselben System zu vergleichen18. Während es systemübergreifende Hardwareunterschiede geben kann, erleichtert die einheitliche Anwendung eines Benchmarking-Protokolls auch den Vergleich der Systemleistung.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Kalibrierung und Probenvorbereitung. Die schrittweise Charakterisierung der Leistung von Magnetmikrospulen wird gezeigt: Kalibrierung der 90° Pulslänge oder Leistung; Bewertung der HF-Feldhomogenität; und Berechnung von SNR pro Volumeneinheit (SNR/mm3). Eine standardisierte Spin-Echo-Messung mit einem Phantom wird beschrieben, um einen Vergleich von Spulenkonstruktionen zu ermöglichen, was die Optimierung unterschiedlicher Anwendungen ermöglicht. Phantom- und biologische Probenpräparate, spezifisch für Mikrospulen, werden beschrieben. Das Protokoll kann auf jedem geeigneten Schmalbohrungs-Vertikalmagneten (≤60 mm) mit einem handelsüblichen Mikroimaging-System implementiert werden. Für andere Systeme kann es als Richtschnur dienen und kann mit einigen Anpassungen verwendet werden.

Die biologische Probenvorbereitung für MRT-Messungen ist in der Regel nicht sehr umfangreich, da die Probe so intakt wie möglich abgebildet ist. Jedoch, Lufträume im biologischen Gewebe können Bildartefakte aufgrund von Unterschieden in der magnetischen Anfälligkeit verursachen19. Der Effekt steigt mit zunehmender Magnetfeldstärke20. Daher sollten Lufträume bei hohen Feldstärken vermieden werden, und dies kann das Eintauchen der Probe in eine Flüssigkeit erfordern, um Luft um das Gewebe herum zu vermeiden und die Entfernung von Lufträumen innerhalb der Gewebestrukturen. Insbesondere bei eingesetzten Mikrospulen kann eine Exzision des gewünschten Probengewebes erforderlich sein, gefolgt von einem Untertauchen in eine geeignete Flüssigkeit. Anschließend wird die Probe in eine vorgeschnittene Kapillare eingeführt und schließlich die Kapillare mit Kapillarwachs versiegelt. Die Verwendung von Wachs als Dichtstoff anstelle von Leim, Flammenversiegelung oder Alternativen bedeutet, dass die Probe leicht extrahiert werden kann. Dieses Verfahren wird an der Wurzel von Medicago-Truncatula, einer kleinen hülsuminösen Pflanze, demonstriert. Ein Vorteil dieses Protokolls ist das Potenzial für die nachträgliche Koregistrierung von MRT-Daten mit optischer Mikroskopie, da die Probe bei der MRT-Messung nicht zerstört wird.

Das vorgestellte Protokoll eignet sich für Messungen mit hoher räumlicher Auflösung vor Ort, und ausgefeiltere Designs könnten die Bildgebung von In-vivo-Proben ermöglichen, bei denen Herausforderungen im Zusammenhang mit lebenserhaltenden Systemen angegangen werden müssten.

Protocol

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Verwendung und Bewertung von Spuleneigenschaften einer 1,5 mm Innendurchmesser (ID) Magnetspule (Abbildung 1). Die Spule, die zum Nachweis des Protokolls verwendet wird, befindet sich in einem mit der Anfälligkeit abgestimmten Reservoir, aber das Protokoll ist auch auf unübertroffene Spulen anwendbar. Das Protokoll kann an andere Größen und verschiedene Spektrometer-Setups angepasst werden. 1. Referenzprobenvorbereitung Um 100 ml der Sensitivitätsreferenzlösung vorzubereiten, lösen Sie 156,4 mg CuSO4 x 5H2O in 80 mlD2O in einem 100 ml GL45 Kolben. Das Kupfersulfat reduziert sowohl die Entspannungszeit von T1 als auch T2 und ermöglicht schnellere Messungen, während dasD2O Strahlungsdämpfungs- und Sättigungseffekte verhindert. Handrühren, bis Feststoffe vollständig aufgelöst sind. Einstellen des Volumens auf 100 ml mit entionisiertem Wasser für eine Endkonzentration von 1 g/L CuSO4 (wasserfrei, 6,3 mM). Diese Konzentration reicht aus, um die Entspannung von T1 und T2 zu verkürzen, aber nicht zu hoch, um von Niederschlägen betroffen zu sein. Versiegeln Sie die Referenzprobe, um eine Änderung des Verhältnisses von H2O:D2O zu verhindern. Alternativ können Sie die Sonde an einen Netzwerkanalysator anschließen, um zu testen, ob die Spule mit der gewünschten Resonanzfrequenz schwingt. Führen Sie einen S11-Reflexionstest durch, um den durch Tuning und für Q-Faktormessungen erreichten Frequenzbereich zu messen, wie von Haase et al.14ausführlich beschrieben. Schließen Sie die Mikrospule über ein koaxiales Kabel an den Netzwerkanalysator an. Verwenden Sie bei Bedarf ein BNC-Adapterkabel. Stellen Sie die Mittenfrequenz am Netzwerkanalysator auf die gewünschte Resonanzfrequenz ein, abhängig von der beabsichtigten Magnetfeldstärke, für die die Spule ausgelegt ist. Als nächstes stellen Sie die Sweep-Breite auf 10 MHz ein. Passen Sie den variablen Kondensator auf der Mikrospulenbaugruppe, falls vorhanden, an der Feinabstimmung des Reflexionsabfalls auf die gewünschte Frequenz an. Zeichnen Sie den Reflexionspegel bei der Mittelfrequenz und die Frequenz f1 und f2 auf der Ebene -7 dB auf. Verwenden Sie diese, um den Q-Faktor auf -7 dB-Niveau nach Haase et al.14 zu berechnen. 2. Probenvorbereitung Wenn Sie eine Referenzprobe für die Spulenkalibrierung vorbereiten, übertragen Sie 1 ml CuSO4-Lösung auf eine Uhrglasschale unter einem Stereomikroskop. Bei der Vorbereitung einer biologischen Probe 1 ml Perfluorodecalin (PFD) in ein Uhrenglas unter einem Stereomikroskop übertragen, das zum Untertauchen der Probe verwendet wird. PFD wird verwendet, da es Lufträume in der Probe füllen kann, ohne in biologische Zellen einzudringen. Es ist auch nicht durch Proton MRT beobachtbar. Bedecken Sie das Uhrenglas sofort mit einem Petrischalendeckel, um Verdunstungsverluste zu verhindern, bevor die PFD benötigt wird.HINWEIS: PFD ist sehr volatil und ein starkes langfristiges Treibhausgas21. Wenn seine sauerstofflösenden Eigenschaften und seine niedrige Viskosität nicht erforderlich sind, kann es durch Fomblin ersetzt werden, ein Perfluorether, das auch kein beobachtbares 1H Signal gibt, aber nicht so schnell verdunstet17. Schneiden Sie Kapillaren mit geeignetem Außendurchmesser auf Größe, passen Sie in den Durchmesser des Mikrospulenhalters (18 mm) und ermöglichen Sie eine Neupositionierung (Abbildung 1C). Verwenden Sie einen Keramikschneider, um alle 10-12 mm einen Schnitt zu machen und vorsichtig am Einschnittpunkt zu brechen. Wenn Sie eine Referenzprobe vorbereiten, verwenden Sie eine Pinzette und das Stereomikroskop, um eine vorgeschnittene Kapillare mit der Oberfläche der CuSO4-Lösung im Uhrenglas in Kontakt zu bringen, so dass kapillare Wirkung die Kapillare füllen kann. Wenn Sie eine biologische Probe vorbereiten, verwenden Sie eine Pinzette und ein Stereomikroskop, um eine vorgeschnittene Kapillare in Kontakt mit der Oberfläche der PFD im Uhrenglas zu bringen, so dass kapillare Wirkung die Kapillare vollständig füllen kann. Lassen Sie die Kapillare in das Uhrenglas, so dass sie vollständig untergetaucht wird. Extrahieren Sie vorsichtig ein fünf Wochen altes ganzes Wurzelsystem aus seinem Wachstumssubstrat, wie z. B. einen Perlitbodenersatz. Reinigen Sie die Wurzelprobe akribisch von Rhizosheath. Entfernen Sie große Bodenpartikel mit einer Pinzette, und wenn kleinere Partikel vorhanden sind, entfernen Sie sie, indem Sie das Wurzelsystem mit destilliertem Wasser waschen. Fotografieren Sie bei Bedarf für zukünftige Referenzen. Wählen und verbrauchen Sie einen kleinen Abschnitt der Faserwurzel frei von Rhizosheath mit einem Skalpell. Für die Vakuumbehandlung die Probe in ein 1,5 ml-Rohr geben, das eine geeignete fixative Lösung enthält. Lassen Sie die Rohrkappe aus, und versiegeln Sie dann das Rohr mit Parafilm, um die Öffnung des Rohres zu versiegeln. Dann Lochlöcher in der Folie mit einem scharfen Werkzeug, um eine Belüftung des Rohres zu ermöglichen. Legen Sie das Probenrohr in eine Vakuumkammer, versiegeln Sie die Kammer und schließen Sie eine Labormembran-Vakuumpumpe an die Kammer an. Die Probe bis zu 30 Minuten einer Vakuumbehandlung unterziehen, um das Vorhandensein von Lufttaschen in biologischen Proben zu verringern. Halten Sie die Vakuumbehandlung an, wenn keine Luftblasen gesehen werden, die der Probe entkommen. Verwenden Sie beim Betrachten eines Stereomikroskops eine Pinzette, um die Probe in das zuvor vorbereitete Infiltrationsmedium einzutauchen. Waschen Sie die Probe von potenziellen Ablagerungen. Setzen Sie die Probe mit einer Pinzette in die Kapillare ein, während sowohl die Kapillare als auch die Probe vollständig untergetaucht sind, um das Einschließen von Luftblasen zu vermeiden. Verwenden Sie eine kleinere Kapillar- oder Spritzennadelspitze als Schubstange (Abbildung 2B). Nehmen Sie die Probe Kapillare aus dem medium Uhr Glas, mit Pinzette. Bei PFD den Petrischalendeckel abdecken. Formen Sie das Tissuepapier zu einem feinen Punkt und verwenden Sie es, um ca. 1 mm Flüssigkeit von beiden Enden der Kapillare zu entfernen. Schmelzen Sie ein kleines Volumen Kapillarwachs mit einem Wachsstift. Wachs auf beiden Seiten auftragen. Das Wachs wird undurchsichtig, wenn es erstarrt. Achten Sie darauf, Luftblasen von der Kapillare auszuschließen (Abbildung 2C).HINWEIS: Vermeiden Sie eine Überhitzung von Wachs oder Kapillare, da dies explosives Abkochen sowie Kavitationstaschen verursachen kann, wenn die fertige Probe abkühlt. Anschließend überschüssiges Wachs von der Außenseite der Kapillare mit einem Skalpell abkratzen und mit feinem Gewebepapier abwischen. 3. Montage der Probe Legen Sie eine Mikrospule unter das Stereomikroskop und legen Sie die Probe mit einer Pinzette ein, während sie die Mikrospule stabil hält (Abbildung 2D). Verwenden Sie eine Stange, um die Probe in der Mikrospule zu zentrieren, indem Sie die Kapillare in die Magnetspule schieben. Optional klebeband auftragen, um die Position der Kapillare zu fixieren. Prüfen Sie die Kapillare, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen innerhalb der Magnetspule sichtbar sind, um eine MR-Signalzerstörung durch Anfälligkeitsunterschiede zu vermeiden. Befestigen Sie die Mikrospule an der Buchse der Sondenbasis, während Sie die Mikrospule aufrecht halten (Abbildung 3A,3B). Schieben Sie die dreiachsigen Gradientenspulen vorsichtig über die Mikrospule, während Sie die Wasserkühlverbinder des Gradienten an den der Sondenbasis anpassen (Abbildung 3C). Drehen Sie das Schraubgewinde auf der Sondenbasis, um den Farbverlauf an Ort und Stelle zu fixieren.HINWEIS: Dieser Schritt gilt nur für eine Micro5-Sonde. Bei anderen Systemen wie Micro2.5 oder Biospect befinden sich die Steigungen auf einer separaten Buchse als die Spule. 4. Bestimmung der Spuleneigenschaften Wenn die Spule zum ersten Mal getestet wird, verwenden Sie die Referenzprobenlösung, um eine homogene Probe zu erstellen, die für die Leistungskalibrierung und B1-Homogenitätstests nützlich ist. Potenzielle Anfälligkeitsprobleme aufgrund der Spulendrähte können mit dieser Referenzprobe leicht getestet werden. Setzen Sie die Sonde in den Magneten ein und schließen Sie die notwendigen Kabel an: HF-Sende-/Empfangskabel, Wasserkühlleitungen, Thermoelementkabel und Luftkühlleitung. Stellen Sie die gewünschte Wasserkühltemperatur (empfohlen 298 K) für die Wasserkühleinheit ein. Legen Sie die Zieltemperatur (298 K) und den Zielgasstrom (300 L/h) fest. Der Gasstrom kann bei einem anderen Spulendesign oder Probenvolumen unterschiedlich sein. Dies gilt nur für Systeme mit Temperaturregelung.HINWEIS: Die nächsten Schritte sind nur erforderlich, wenn neue (selbstgebaute) Spulen getestet werden. Schließen Sie die Sonde mit einem 50-Ω-Koaxialkabel an einen Netzwerkanalysator mit einer entsprechend breiten Sweep-Breite (400 MHz) an, die auf der vorgesehenen Resonanzfrequenz zentriert ist. Beobachten Sie die Resonanzmodi, indem Sie die variablen Matching- und Tuning-Kondensatoren anpassen, die in der Sondenbasis vorhanden sind. Stimmen Sie den Resonanzmodus auf die gewünschte Frequenz ab und passen Sie sie an. Bestimmen Sie optional den Spulenqualitätsfaktor (Q-Faktor) im Netzwerkanalysator. Eine Methode, um den Qualitätsfaktor zu erhalten, besteht darin, ein Kopplungsnetz zu verwenden und die Mittelfrequenz (fc) durch die Breite des Reflexionsdips bei -7 dB (d.h. Q = fc /(f1 – f2)14zu dividieren. Setzen Sie fc auf die Betriebsfrequenz des Magneten, während f1 und f2 auf den -7 dB-Punkt links bzw. rechts von fceingestellt sind. Einige Netzwerkanalysatoren verfügen über integrierte Q-Faktor-Ermittlungen. Initiieren Sie einen Reflexionstest auf dem Scanner, der in der Regel als Wackelkurve bezeichnet wird, und passen Sie die Abstimmung und Abstimmung bei Bedarf an. Es wird empfohlen, alle Tuning- und Matching-Kondensatoren auf den Mittelpunkt ihres Sortiments für neue Spulen einzustellen. Beginnen Sie daher mit einer hohen spektralen Sweep-Breite. In einigen Fällen ist es möglicherweise bequemer, die Spule außerhalb des Magneten auf einem Netzwerkanalysator zu stimmen und abzugleichen. Wählen Sie eine Shim-Datei für die größte Volumenspule der Bildsonde aus, sofern sie verfügbar ist. Wenn Sie von einer zuvor verwendeten Spule ausstarten, verwenden Sie eine verfügbare Shim-Datei. Wenn beide Optionen nicht verfügbar sind, beginnen Sie mit allen shim-Werten, die auf 0 gesetzt sind. Wählen Sie die richtige Spulenkonfiguration für die Mikrospule aus, wenn sie in der Bildverarbeitungssoftware (z. B. ParaVision) verfügbar ist. Andernfalls erstellen Sie eine neue Spulenkonfiguration, die den Spezifikationen der Spule entspricht (z. B. ein- oder doppelt abgestimmt) entsprechend dem Systemhandbuch. Die Schätzungen für die sicheren Grenzwerte für diese Magnetmikrospule, die in dieser Forschung mit 1,5 mm Innendurchmesser verwendet wird, betragen 1 ms bei 1 W Spitzenleistung und 1 mW Dauerleistung.VORSICHT: Die für Mikrospulen benötigten kleinen Kondensatoren (typischerweise 1 mm groß) sind hochempfindlich und können leicht durch hohe Spannungen beschädigt werden. Die automatisierte Pulsleistungsbestimmung funktioniert möglicherweise nicht mit nicht standardmäßigen Spulen, und zu hohe Kräfte können Schäden an der Spule oder anderen Teilen des Spektrometers verursachen. Daher werden manuelle Anpassungen empfohlen. Zeichnen Sie eine Nutationskurve für eine neue Spule auf, um eine Anzeige der richtigen HF-Leistung für die Spule zu erhalten (Abbildung 4). Falls die sicheren Grenzwerte für die Spule unbekannt sind, beginnen Sie mit 10 s bei einer niedrigen Impulsleistung von 0,6 W und erhöhen Sie langsam die Pulslängen um jeweils 1 s, bis das Signal erscheint. Mit einem FID-Experiment in Abwesenheit von Gradientencodierung, variieren Sie die HF-Pulslänge systematisch unter Beibehaltung der Pulsleistung konstant. Die ideale Pulslänge ist die Pulslänge, bei der die Signalintensität das Maximum erreicht. Wenn Sie eine neue Spule testen, verwenden Sie zuerst einen 10-s-Impuls mit einer sehr niedrigen Leistung und beginnen Sie, die Pulsleistung schrittweise zu erhöhen.HINWEIS: Falls die Leistung für die Kombination von Spuleneigenschaften und Spektrometer viel höher ist als erwartet, ist dies bereits ein Hinweis darauf, dass der falsche Resonanzmodus gewählt wurde. Für eine Spule mit einem homogenen B1-Feld,wie eine Magnetspule, bestimmen Sie den 180°-Impuls, bei dem die Signalintensität auf Null22abnimmt. Stellen Sie die ermittelte 90°-Impulsleistung in die Einstellkarte der erstellten Studie ein. In ParaVision kann die Referenzleistungseinstellungskarte verwendet werden, um die harte Pulsleistung einzugeben. Verwenden Sie einen Lokalisierer-Scan mit 3 Slices, einem Slice in jeder der drei Primärachsen, um die Position der Spule innerhalb des Magneten zu lokalisieren. Laden Sie dazu einen Localizer-Scan aus der Standardbibliothek des Spektrometers. Es wird empfohlen, mit einem großen Sichtfeld ohne Offset zu beginnen. Führen Sie eine automatische Empfängerverstärkungseinstellung durch und starten Sie die Messung manuell.HINWEIS: Wenn sich das Beispiel genau in der Mitte des Gradientensystems befindet, zeigt der Lokalisierer-Scan das Sample an. Wenn die Spule oder Probe nicht in den Bildsegmenten zentriert ist oder fehlt, muss der Lokalisierer-Scan angepasst werden, in diesem Fall muss Schritt 4.12 erneut durchgeführt werden. Alternativ können Sie alternativ den richtigen 90°-Impuls auf Basis der Bildauswertung finden. Sobald eine ungefähre Impulsleistung mit Hilfe der Nutationskurve gefunden wird,passen Sie die Pulskräfte schrittweise an, um das Bild auf B1-Feldhomogenität zu überprüfen. Bei einigen Spulen mit einem inhomogenen B1-Feld kann die mit der Nutationskurve ermittelte 90°-Impulsleistung überschätzt werden, was zu einem Überkippen im gewünschten Sweet Spot der Spule führt. Reduzieren Sie in diesem Fall die Referenzimpulsleistung und überprüfen Sie die neuen Bilder mit den vorherigen Bildern (Abbildung 5). Das Magnetfeld wird manuell auf Basis des FID-Signals shim. Eine empfohlene Bestellung für die Erstaufnahme ist Z-Z2-Z-X-Y-Z-Z2-Z-XY-XZ-YZ-Z. Bei einem Magnet befindet sich die Hauptsymmetrieachse in der XY-Ebene. Daher können Shims in verschiedene Richtungen zu einer stärkeren Korrektur der B0 Homogenität für diese Spulenkonfiguration führen. Shims höherer Ordnung haben wenig Wirkung und können ignoriert werden. Berechnen Sie einen volumennormalisierten SNR, um einen Vergleich der Mikrospuleneigenschaften über verschiedene Systeme hinweg zu ermöglichen, angepasst aus dem Herstellerprotokoll18. Für die hier verwendeten Mikrospulen haben wir eine Spin-Echo-Sequenz mit den folgenden Parametern verwendet: Feld-ansicht (FOV) 6 mm x 6 mm, Wiederholungszeit (TR) 1000 ms, Echozeit (TE) 7 ms, Matrix 256 x 256 und Scheibendicke = 0,5 mm. Passen Sie die Scheibendicke an, bis die Empfängerverstärkung einheit ist. Passen Sie als Nächstes die Anzahl der Slices so an, dass Slices über den Bereich der HomogenitätdesB1-Feldeshinausgehen. Zeichnen Sie die Bilder, wenn möglich, ohne Signalmittelung auf. Bestimmen Sie das volumennormalisierte SNR (SNR/mm3) in zwei Schritten. Berechnen Sie zunächst das Voxelvolumen (Vvoxel)(Eq. 1):(1)HINWEIS: Die Einheiten für Dx, Dy und DSlice sind in mm. Diese Berechnung kann ebenfalls für eine Reihe von Slices durchgeführt werden. Wählen Sie die Bereiche von Interesse aus, um die Signalintensität (μROI) der Probe sowie die Signalintensität (μRauschen) und die Standardabweichung (σRauschen) für einen Bereich außerhalb der Probe (d. h. das Rauschen) zu bestimmen. Das mittlere Signal wird von der Mitte des Bildes genommen, während das Rauschsignal aus den Eckflecken berechnet wird (Abbildung 6). Für diese Berechnungen kann entweder die Spektrometersteuerungssoftware oder die allgemeine Bildverarbeitungssoftware verwendet werden. Verwenden Sie nach Möglichkeit eine einzige Wiederholung, um die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Spulen aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie die Werte, um ein volumennormalisiertes SNR (Eq. 2) zu berechnen:(2)Für die hier in Kombination mit der Referenzlösung verwendete Spule ergibt die Verwendung von Eq. 2 folgende Lösung:(3)HINWEIS: Beim Vergleich des SNR von Spulen mit unterschiedlichen Magnetfeldstärken müssen die Entspannungseigenschaften des Phantoms23gemessen werden, es sei denn, es werden eine sehr lange Wiederholungszeit und eine sehr kurze Echozeit verwendet. Überprüfen Sie auf Anfälligkeitsprobleme aufgrund von Magnetfeldinhomogenitäten: Laden und führen Sie eine Sequenz mit mehreren Gradientenechos (MGE) aus (Abbildung 7). Magnetfeldinhomogenitäten aufgrund von Anfälligkeitsunterschieden sind in den Bildern mit längeren Echozeiten sichtbar, da das Gradientenecho keine Spins neu fokussiert, die aufgrund statischer Feldinhomogenitäten dephase. Auf diese Weise können Inhomogenitäten in der Probe visualisiert werden (aufgrund von Lufträumen in der Probe), sowie B 0-Feldinhomogenitäten, die durch das Spulenmaterial eingeführt werden. Verwenden Sie die folgenden Parameter, die je nach den Spezifikationen des verwendeten Spektrometers und der verwendeten Spule angepasst werden: TR 200 ms, TE 3,5 ms mit 48 Echos im Abstand von 3,5 ms, Drehwinkel 30 Grad. Matrixgröße 128 x 128.HINWEIS: Wenn mehrere (potenzielle) Resonanzmodi oder Reflexionseinbrüche in der Resonanzkurve (Wackelkurve) beobachtet wurden, wiederholen Sie die oben genannten Schritte für jeden Resonanzmodus, um den empfindlichsten zu bestimmen. Je nach Mikrospule können verschiedene Teile der Mikrospulenbaugruppe anfällig für unbeabsichtigte Resonanzmodi sein. 5. Hochauflösende Bildgebung Führen Sie ein 3D-FLASH-Experiment mit den folgenden Parametern durch: TR 70 ms, TE 2,5 ms, Matrixgröße 128 x 64 x 64, FOV 1,6 x 0,8 x 0,8 mm, Drehwinkel 30° und Empfängerbandbreite 50 kHz. Leiten Sie die Pulskräfte von der zuvor ermittelten Referenzimpulsleistung ab; Dies ist in den meisten Imaging-Software automatisch. Bestimmen Sie die Empfängerverstärkung mit automatischen Anpassungen. Passen Sie ggf. den FOV an und decken Sie das gesamte Objekt in beiden Phasenkodierungsrichtungen ab, um Aliasing zu vermeiden. Führen Sie eine Gradienten-Zyklussimulation aus, sofern auf dem System verfügbar, um sicherzustellen, dass der Betriebszyklus des Experiments innerhalb der Spezifikationen der Gradientenspulen bleibt.ANMERKUNG: Diese Parameter sind spezifisch für die spule, die für die Demonstration verwendet wird; es ist wichtig, die spezifischen Spezifischen des lokalen Systems zu optimieren. 6. Wiederherstellung von Proben für weitere Untersuchungen oder Lagerungen Entfernen Sie die Probenkapillare aus der Mikrospule. Entfernen Sie die Wachsstopfen mit einer Pinzette unter einem Stereomikroskop. Verwenden Sie eine Spritze, um die Probe mit einer Lösung der Wahl aus der Kapillare zu waschen. Alternativ können Sie die Probe mit einer Glasschieberstange auswerfen. Um eine Austrocknung der Probe zu verhindern, lagern Sie sie in einem geeigneten Medium für die Lagerung auf.

Representative Results

Coil-CharakterisierungBei erfolgreicher Abstimmung und Abstimmung einer Spule kann ihre Leistung durch den Spulen-Q-Faktor, den 90°-Referenzimpuls und SNR/mm3gekennzeichnet sein. Für die hier gezeigte 1,5-mm-ID-Empfindlichkeits-angepasste Magnetspule betrug der gemessene Q-Faktor (unbelastet) 244, verglichen mit 561 für eine 5 mm Vogelkäfigspule. Der Referenzimpuls von 90° betrug 12 s bei einem Leistungsniveau von 0,6 W; vgl. 5 s bei 45 W für eine 5 mm Vogelkäfigspule(Abbildung 4 und Abbildung 5). Dies entspricht einer HF-Pulsfeldstärke (B1), wobei 0,53 mT für die Mikrospule und 1,17 mT für die Vogelkäfigspule14 verwendet werden, wobei y das gyromagnetische Verhältnis ist, während Tau die Pulsdauer ist. Da sich die Pulsleistungsstufen (P) unterscheiden, können Spulen hinsichtlich der Sendeeffizienz verglichen werden: 0,69 mT/W1/2 und 0,18 mT/W1/2 für die Mikrospule bzw. den Vogelkäfig14. Im Vergleich mit einem 90°-Impuls ist die Mikrospule ein Faktor ≈ 4-mal empfindlicher als die Vogelkäfigspule. Wirkung des AnfälligkeitsabgleichsBei extrem hohen Feldstärken wird die Proben- und Spulenanfälligkeit zu einem dominanten Faktor für die Bildqualität, wie abbildung 7A,7Bzeigt. Im Vergleich zu einer Spule ohne Anfälligkeit, die ein Flüssigkeitsreservoir passt, wird das Signal in einer Referenzprobe länger und homogener zurückgehalten. Aufgrund des Anfälligkeitsreservoirs verringern sich jedoch die maximalen Probenabmessungen in Bezug auf die Spule ohne das Reservoir. Hochauflösende BildgebungEine hohe Auflösung von 13 x 13 x 13 m3 einer Medicago-Truncatula-Wurzelprobe wurde in 20 Stunden und 23 Minuten erreicht (Abbildung 8). Ausgehend von der Oberfläche der Wurzel wird der Wurzelkortex gesehen, zusammen mit etwas Restwasser auf der Außenseite der Wurzel. Darüber hinaus wird das Xylem als dunkles Band beobachtet, das das Phloem umschließt. Einige Lufttaschen werden als dunkle Flecken mit vollständigem Signalverlust beobachtet. Symbiotische Wurzelknollen von M. truncatula können auch mit diesem Protokoll abgebildet werden (Abbildung 9). Mit einer etwas größeren unübertroffenen Spule (Länge ca. 3500 m, Innendurchmesser 1500 m) wurden in 33 Minuten Bilder mit einer Auflösung von bis zu 16 x 16 x 16 m3 erhalten. Abbildung 1: Eine Magnet-Mikrospule. (A) Das Magnetspulendesign besteht aus drahtgeschliffenem Helix, typischerweise um eine Kapillare gewickelt. Die Geometrie des Drahtes, z. B. Dicke, Durchmesser, Anzahl der Wicklungen und Drahtabstand, beeinflusst die Spuleneigenschaften. (B) Eine selbst gebaute Magnetmikrospule mit einem Reservoir für anfällige Flüssigkeit (Fomblin). Es besteht aus einem 0,4 mm dicken beschichteten Kupferdraht, der sechsmal um die Kapillare gewickelt wird, mit einem Außendurchmesser von 1500 m und einer Spulenlänge von 3500 m. Die Spule wird in ein Reservoir getaucht, das aus einer Spritze hergestellt wird. Probenkapillaren bis zu einem Außendurchmesser von 1000 m können eingesetzt werden. Es werden zwei Kondensatoren verwendet, ein 1,5 pF-Kondensator in Serie mit der Induktivität und ein zweiter variabler 1,5-6 pF-Kondensator wird parallel zur Induktivität platziert. Alle Komponenten werden auf eine Glasfaserplatte (gelb) gelötet. Es ist auf einem kommerziellen Halter (graues Polymer) montiert, das modifiziert wird, um das Reservoir zu stützen.  (C) Magnetspulen-Designkomponenten: 1. Magnetspule, 2. Probenkapillare, 3. 1,5 pF Tuning-Kondensator, 4. variabel passender Kondensator, 5. Fiberglas-Grundplatte, 6. Kupferdrahtleitungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Probenvorbereitung unter einem Stereomikroskop. (A) Gegenstände, die für die Herstellung von Mikrospulen benötigt werden. Von links nach rechts: 1. CuSO4 Referenzlösung, 2. Perfluorodecalin, 3. Mikrospule, 4. Skalpell, 5. positive Spannungspinzezette, 6. Pinzette, 7. Kapillaren Außendurchmesser = 1000 m, 8. Wachsstift, 9. Kapillarwachs, 10. Nitrilhandschuhe, 11. Stereomikroskop, 12. Uhrglas mit Petrischalenbezug, 13. Pflanzenmaterial im Wachstumssubstrat. Nicht gezeigt: 2 ml Spritze mit 0,8 x 40 mm Nadel und Feinem Tissuepapier. (B) Probeneinfügung mit einer Pinzette in eine Kapillare schließen, während beide unter Getaucht gehalten werden. (C) Versiegelung der Kapillare mit geschmolzenem Wachs. (D) Einstecken der vorbereiteten Kapillare in die Mikrospule. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Die Komponente einer Mikro-Imaging-Sonde. (A) Micro5-Sondenbasis, die alle notwendigen Anschlüsse für Wasserkühlung, Heizung, Temperatursensoren, Gradientenleistung, HF (koaxialer Steckverbinder sichtbar) und optional Sondenidentifikation (PICS) enthält. Unter der Sondenbasis befinden sich Knöpfe, die die Einstellung der variablen Abstimmung und der passenden Kondensatoren ermöglichen, sowie Halteschrauben, um die Sonde im Spektrometer an Ort und Stelle zu halten. (B) Die selbstgebaute Mikrospulenmontage auf der Sondenbasis. Beachten Sie die variablen Kondensatoren (weiße Keramik), die auf der Sondenbasis montiert sind und eine Abstimmung und Abstimmung ermöglichen. (C) Integrierter 3-Axialgradient, der auf der Sondenbasis mit Wasserkühlbehältern und vergoldeten Kontakten zur Erdung des Gradienten montiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Nutationskurve. Zur Bestimmung der Referenzimpulsleistung wird eine Nutationskurve erfasst. Die Referenzpulsleistung (90° Puls) ist definiert als die Kombination von Leistung und Pulslänge, die erforderlich ist, um ein B1-Feld zu erzeugen, das alle verfügbaren Magnetisierungen in z-Richtung in die Querebene umkippt. Eine Reihe von Impulsen wird in Ermangelung einer Gradientencodierung aufgezeichnet. Bei jedem Puls wird entweder Pulslänge oder Pulsleistung erhöht. Hier wird die Pulsleistung auf 0,6 W eingestellt, während die Pulslänge jedes Mal um 1 s erhöht wird. Die maximale Signalintensität gibt den 90°-Impuls um 12 s an. Der 180°-Impuls kann auf diese Weise auch mit der minimalen Intensität bestimmt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Visuelle Bestimmung der 90°-Impulsleistung. Sobald eine ungefähre Referenzpulsleistung mit hilfe einer Nutationskurve gefunden wurde, kann sie visuell durch Variation der Pulslänge überprüft werden. Je nach Spule kann das Feld B1 mehr oder weniger empfindlich auf Veränderungen reagieren. (A) 11 s Pulslänge. (B) 12 s Pulslänge, optimal für diese Spule. (C) 13 s Pulslänge. (D) 20 s Pulslänge. Wenn die Pulsleistung zu hoch eingestellt ist, kann es zu Überkippen kommen, wodurch die Bildintensität in der Mitte der Spule (Pfeilspitze) reduziert wird. Das erhöhteB1-Feld erhöht auch den Bereich der Spule, wie in der Breite des Bildes zu beobachten ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Platzierung der Region von Interesse. Die Interessengebiete (ROI) für die volumennormalisierte SNR-Berechnung sind zu sehen. Die mittlere Probenintensität wird einem ROI entnommen, der in die Referenzlösungsstichprobe fällt. Das mittlere Rauschen und die Standardabweichung werden aus einem oder mehreren ROI in den Ecken des Bildes berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: HF-Homogenität, die durch Gradientenecho-Bildgebung bewertet wird. Eine MGE-Sequenz (Multiple Gradient Echo) wird verwendet, um die HF- (B1 -Field) Homogenität mithilfe einer Reihe von Gradientenechos auszuwerten. Grundparameter waren: Wiederholungszeit 200 ms, Echozeit 3,5 ms mit der Anzahl der Echos 48, Echoabstand 3,5 ms, 64 Mittelwerte, Erfassungszeit 27 m 18 s, Drehwinkel 30°. Sichtfeld war 5 x 5 mm, Matrix 128 x 128, Auflösung 39 x 39 x 200 m. (A) Anfälligkeit abgestimmte Spule. Die Anfälligkeitsübereinstimmungsflüssigkeit (Fomblin) um die HF-Spule reduziert Anfälligkeitseffekte aufgrund des Spulendrahtes. Kleine Luftblasen verursachen Signalverlust, wenn die Echozeit zunimmt. (B) Eine Spule (nicht anfällig) mit gleichem Spulendurchmesser. Bei längeren Echozeiten werden zunehmende Artefakte beobachtet, die durch B 0-Feldinhomogenität verursacht werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 8: 3D-Bildgebung eines Medicago-Truncatula-Wurzelabschnitts. (oben) FLASH-Bild. Es können mehrere Merkmale des Wurzelabschnitts unterschieden werden, darunter epidermis (e), Cortex (c), Phloem (ph) und Xylem (xy). Lufttaschen (a) in der Wurzel verursachen vollständigen Signalverlust. Die Grundparameter waren wie folgt: Wiederholungszeit 70 ms, Echozeit 2,5 ms, 256 Mittelwerte, Erfassungszeit 20 h 23 m. Auflösung 13 x 13 x 13 x3. Matrixgröße war 128 x 64 x 64 und Sichtfeld 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Empfängerbandbreite 50 kHz. (Unten) MSME-Bild. Die Grundparameter waren wie folgt: Wiederholungszeit 500 ms, Echozeit 5,2 ms, 28 Mittelwerte, Erfassungszeit 15 h 55 m. Auflösung 13 x 13 x 13 x3. Matrixgröße war 128 x 64 x 64 und Sichtfeld 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Empfängerbandbreite 70 kHz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 9: 3D-Bildgebung eines Medicago-Truncatula-Wurzelknotens. (oben) Bild mit niedriger Auflösung. Die Grundparameter waren wie folgt: Wiederholungszeit 60 ms, Echozeit 2,3 ms, 4 Mittelwerte, Erfassungszeit 4 m. Auflösung 31 x 31 x 31 x31. Matrixgröße war 64 x 32 x 32 und Sichtfeld 2 x 1 x 1 mm. Empfängerbandbreite 50 kHz. (Unten) Hochauflösendes Bild. Die Grundparameter waren wie folgt: Wiederholungszeit 60 ms, Echozeit 2,3 ms, 8 Mittelwerte, Erfassungszeit 33 m. Auflösung 16 x 16 x 16 x3. Matrixgröße war 128 x 64 x 64 und Sichtfeld 2 x 1 x 1 mm. Empfängerbandbreite 50 kHz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Dieses Protokoll eignet sich am besten für biologische Proben, da viele Materialien und geologische Proben deutlich kürzere T2-Entspannungszeiten aufweisen, die sich nicht anhand der hier verwendeten Sequenzen abbilden lassen. Selbst einige biologische Gewebe, die eine hohe magnetische Anfälligkeitsheterogenität aufweisen, können im ultrahohen Feld schwer abzubilden sein, da die Effekte mit der Feldstärke24korreliert sind. Das Protokoll ist nicht nur für neue Spulen nützlich, sondern kann auch bei der Fehlerbehebung und Diagnose potenzieller Probleme helfen. Beim Testen neuer oder unbekannter Beispiele kann dieses Protokoll im Voraus auf der Referenzlösung ausgeführt werden, um zu überprüfen, ob der Versuchsaufbau gemäß den Spezifikationen funktioniert. Dies hilft bei der Fehlerbehebung, da das Spektrometer als Quelle von Artefakten und Fehlfunktionen ausgeschlossen werden kann. Darüber hinaus werden die Tuning- und Matching-Kondensatoren auf der Sonde auf die für die Mikrospule typischen Werte festgelegt.

Wenn beim ersten Experiment kein Signal aufgezeichnet wird, kann das Sichtfeld des Lokalisiererscans vergrößert werden, um zu überprüfen, ob die Probe gesehen wird. Überprüfen Sie als Nächstes erneut, ob die Spule richtig abgestimmt ist, und versuchen Sie einen weiteren Lokalisierer-Scan. Es ist möglich, dass die Spule zusätzliche unbeabsichtigte Resonanzmodi aufweist, in diesem Fall muss der richtige bestimmt werden. Wenn immer noch kein Bild erhalten werden kann, entfernen Sie die Probe, um ihre Position innerhalb der Mikrospulenbaugruppe zu überprüfen und zu überprüfen, ob die Probe intakt ist (d. h., es sind keine Luftblasen oder Lecks in den Dichtungen vorhanden). Schließlich kann eine Probe mit Wasser anstelle von PFD vorbereitet werden. Falls die Probe im Lokalistorscan wenig nachweisbares Signal liefert, kann das umgebende Wasser in der Kapillare noch erkannt werden.

Da Mikrospulen idealerweise sehr nahe an der Probe sind, können die magnetischen Anfälligkeitsunterschiede zwischen Luft und Draht zu zusätzlichen Signalverlusten führen, wie in Abbildung 7Bzu sehen ist. Mögliche Artefakte sind räumliche Fehlzuordnungen und anomale Signalintensitätsvariationen. Besonders Gradienten-Echo-Pulssequenzen werden von diesem ungleichmäßigen Signalverlust beeinflusst. Aus diesem Grund haben wir eine mit der Anfälligkeit abgestimmte Spule vorgestellt, indem wir den Draht in Fluoreratflüssigkeit (Fomblin oder FC-43) getaucht haben. Die in diesem Protokoll enthaltene B1-Schätzmethode kann helfen festzustellen, ob die B1-Anfälligkeitsunterschiede die Einbeziehung von Anfälligkeitsabgleichsstrategien in die Konstruktion der Spulenbaugruppe rechtfertigen. Ein alternativer Ansatz für den Bau einer anfälligen spulen ist die Verwendung von anfälligitätsgerechtem Draht25. Darüber hinaus werden mit diesem Ansatz nur Anfälligkeitsprobleme aufgrund der Spule angegangen. Die Anfälligkeitsübereinstimmungen innerhalb der Probe (z. B. aufgrund von Lufträumen) bleiben herausfordernd.

Lufttaschen oder Blasen stellen eine experimentelle Herausforderung dar, die einen umfangreichen Signalverlust verursacht, der durch Anfälligkeitsunterschiede an der Schnittstelle der Luft und der Flüssigkeit oder Probe19 verursacht wird (Abbildung 5A). Ein kritischer Aspekt der erfolgreichen Probenvorbereitung ist das Untertauchen sowohl der Probe als auch der Kapillare. Aber auch kleine Blasen können Signalverluste verursachen, insbesondere bei Gradientenecho-Typsequenzen. Mobile Luftblasen können durch die Kapillare wandern, bis sie mit der Probe in Kontakt sind. Einige dieser Effekte können durch leichtes Kippen der Kapillare gemildert werden, so dass ein Ende höher als das andere ist. Das Kippen stellt sicher, dass potenzielle Luftblasen am oberen Ende gehalten werden, ohne die Probe zu stören. Es ist auch wichtig zu überprüfen, ob das Kapillarwachs eine gute Dichtung bildet, da Austrocknung große Luftblasen bilden kann.

Für die Lufträume innerhalb der Probe wurde PFD verwendet, um die interzellulären Lufträume zu füllen, ohne in die Zellmembraneneinzudringen 26. Doch selbst mit diesem Ansatz konnten wir nicht alle Lufträume entfernen. Darüber hinaus bedeutet dieser Ansatz, dass wir einen zusätzlichen Wirkstoff benötigen, der in der Regel nicht bevorzugt wird, weil wir ein System so uninvasive wie möglich untersuchen wollen.

Die zylindrische Form von Kapillaren bedeutet, dass Perfusions-Setups lebensfähig sein sollten, insbesondere für Gewebe, die anfällig für Zerfall sind, wie Biopsien oder Studienprozesse in lebenden Wurzelmaterial. Zwei Schritte könnten ein Perfusions-Setup realisieren. Erstens würde der Anschluss eines mittleren Vorschubrohrs sowie eines Abflussrohrs auf beiden Seiten der Kapillare ausreichen, um ein Chemostat zu erzeugen. Zweitens könnte die Zugabe eines Einzugs in die Probenkapillare die Probe gegen die Strömungsrichtung an Ort und Stelle halten. Dies entspricht einem Protokoll, das für planare Mikrospulen10veröffentlicht wurde.

Die nichtinvasive Natur der MR-Bildgebung in Kombination mit der in diesem Protokoll verwendeten inerten Flüssigkeit (PFD oder Fomblin) bedeutet, dass nach Abschluss der Versuche Proben zur weiteren Untersuchung aus ihren Kapillaren entfernt werden können. Zu den Kombinationen gehören optische oder Elektronenmikroskopie und andere zerstörerische Bildgebungstechniken. Wir haben vor kurzem eine Kombination mit optischer Mikroskopie auf Medicago truncatula Wurzelknötchen27demonstriert.

Wir haben ein Verfahren zur Abbildung von Pflanzenmaterial mit speziellen Mikrospulen auf einem Ultra-High-Field-NMR-Spektrometer demonstriert. Relativ große Probenvolumina können mit hoher Auflösung bei guter HF-Homogenität untersucht werden. Darüber hinaus kann die spektroskopische Bildgebung mit höheren Auflösungen als sonst möglich durchgeführt werden. Die Anpassung des Mikrospulendesigns an Proben wird durch eine effiziente Methode zur Bestimmung der Spulenleistungsmerkmale erleichtert. Der Magnetspulenansatz kann auch leicht auf andere Proben als Pflanzen angewendet werden, einschließlich tierischem Gewebe.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Experimente am 950-MHz-Instrument wurden von uNMR-NL unterstützt, einer von der NWO finanzierten Nationalen Roadmap-Großfazilität der Niederlande (Projekt 184.032.207). R.S. wurde vom BioSolarCells-Konsortiumsprojekt U2.3 unterstützt. J.R.K. wurde von der niederländischen Magnetic Resonance Research School (NMARRS) Graduate School [022.005.029] unterstützt. Wir danken Defeng Shen und Ton Bisseling für die Bereitstellung der Medicago-Truncatula-Proben. Wir danken auch Klaartje Houben, Marie Renault und Johan van der Zwan für die technische Unterstützung im uNMR-NL Werk. Wir danken auch Volker Lehmann, Henny Janssen und Pieter de Waard für die technische Hilfe. Wir danken Frank Vergeldt, John Philippi und Karthick B. Sai Sankar Gupta für ihren Rat. Abschließend danken wir Jessica de Ruiter für die Bereitstellung des Voice-Over summat für das Video.

Materials

Reference solution preparation
CuSO4 Sigma-aldrich 469130 Crystalline powder for creating reference solution
D2O Sigma-aldrich 151882 Liquid used to prepare reference sample
Weigh Scale Sartorius PRACTUM513-1S Scale for weighing compounds
Sample preparation
Capillary 1000 μm (Outer diameter) Hilbenberg GmbH 1408410 Sample capillaries
Capillary wax Hampton Research HR4-328 Solid wax used to seal samples
Disposable Scalpel Swann-Morton No. 11 Used to excise samples
Perfluorodecalin Sigma-aldrich P9900 Liquid used for submerging sample
Stereo Microscope Olympus SZ40 Tabletop binocular microscope
Syringe Generic – Used to apply PFD and manipulate the sample
Vacuum Pump Vacuubrand MZ2C Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples.
Wax pen Hampton Research HR4-342 Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples
Imaging Hardware
22.3 T Magnet Bruker GmbH 950 US2 Narrowbore superconducting magnet
Air cooler Bruker GmbH – Used to regulate probe temperature
Console Bruker GmbH Avance III HD Controls operation of the spectrometer
Micro5 gradient coils Bruker GmbH Mic5 Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body
Micro5 Probe body Bruker GmbH Mic5 Holds microcoils and gradient coils
RF microcoil Home-built – contains Fomblin
Vector Network Analyzer Copper Mountain Technologies TR1300/1 Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz
Water cooler Bruker GmbH BCU-20 Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation.
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van Schadewijk, R., Krug, J. R., Webb, A., Van As, H., Velders, A. H., de Groot, H. J. M., Alia, A. MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T. J. Vis. Exp. (167), e61266, doi:10.3791/61266 (2021).
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