Extracción rápida y rentable de ARN de tejido pancreático de rata
Summary
La pureza e integridad del ARN aislado es un paso vital en los ensayos dependientes del ARN. Aquí, presentamos un método práctico, rápido y barato para extraer el ARN de una pequeña cantidad de tejido pancreático no dañado.
Abstract
Independientemente del método de extracción, la extracción optimizada de ARN de tejidos y líneas celulares se lleva a cabo en cuatro etapas: 1) homogeneización, 2) desnaturalización efectiva de proteínas de ARN, 3) inactivación de la ribonucleasa, y 4) eliminación de la contaminación del ADN, proteínas y carbohidratos. Sin embargo, es muy laborioso mantener la integridad del ARN cuando hay altos niveles de RNase en el tejido. La autolisis espontánea hace que sea muy difícil extraer ARN del tejido pancreático sin dañarlo. Por lo tanto, se necesita un método práctico de extracción de ARN para mantener la integridad de los tejidos pancreáticos durante el proceso de extracción. Se llevó a cabo un estudio experimental y comparativo de los protocolos existentes obteniendo 20-30 mg de tejidos pancreáticos de rata en menos de 2 minutos y extrayendo el ARN. Los resultados fueron evaluados por electroforesis. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces para la generalización de los resultados. Sumergir el tejido pancreático en el reactivo de estabilización de ARN a -80 oC durante 24 horas produjo ARN de alta integridad, cuando se utilizó el reactivo de extracción de ARN como reactivo. Los resultados obtenidos fueron comparables a los resultados obtenidos de kits comerciales con fijaciones de columna de espín.
Introduction
Los datos genéticos estructurales se pueden transcribir a un producto funcional a través de la expresión génica. El análisis de ARN se utiliza para descubrir diferencias en la expresión génica en diferentes condiciones. Hay una serie de métodos para extraer ácidos nucleicos de la siguiente manera: guanidinio tiocianato, extracción a través de fenol-cloroformo, cromatografía a base de celulosa, extracción por matrices de sílice, y anión-intercambio1,2.
La detección adecuada de la expresión génica está influenciada por la integridad del ARN aislado de los tejidos; por lo tanto, es vital evaluar la integridad del ARN aislado de los tejidos antes de que se lleven a cabo nuevas pruebas, ya que las pruebas moleculares complementarias en ARN de baja calidad pueden poner en peligro los resultados de las aplicaciones diagnósticas. Por lo tanto, se necesita ARN de alta integridad para pruebas biológicas moleculares con diferentes aplicaciones de diagnóstico: RT-PCR cuantitativo, micro-arrays, ensayo de protección ribonucleasa, análisis de manchas del norte, mapeo de ARN y construcción de bibliotecas cDNA3,,4.
El ARN se vuelve bastante inestable después de ser mantenido durante mucho tiempo. Los fragmentos largos de ARNm de más de 10 kb son particularmente susceptibles a la degradación5,,6. Por lo tanto, los investigadores deben considerar varios factores que influyen en la integridad del ARN purificado. La pureza del ARN debe protegerse contra las arnés, las proteínas, el ADN genómico y la contaminación por inhibidores enzimáticos. Además, la mejor y aceptable relación de absorción de ARN a UV (260/280) debe estar dentro del rango de 1,8-2,0 con una fragmentación mínima sobre la electroforesis. Técnicas de laboratorio desarrolladas recientemente han permitido a los científicos evaluar la integridad de la muestra de análisis molecular más prácticamente7,8.
Es mucho más difícil extraer ARN no dañado del tejido pancreático que otros tipos de tejidos debido a la alta cantidad de ribonucleas (ARN). Sin embargo, los métodos de extracción existentes, a saber, la rápida expulsión del tejido pancreático de la cavidad abdominal y la homogeneización a bajas temperaturas para impedir las redes, han demostrado ser ineficaces7,8,9,10,11,12,13,14.
El propósito del presente estudio experimental comparativo es modificar y comparar los métodos existentes para determinar los métodos más eficientes. Con ese fin, se modificaron y compararon varios protocolos de extracción de ARN. Estaba dirigido específicamente a determinar el método menos costoso que requiere una cantidad mínima de tejido pancreático.
Protocol
Representative Results
Discussion
En biología molecular es vital obtener ARN de alta calidad. La presencia de las enzimas ribonucleasa en células y tejidos degrada rápidamente el ARN y hace que la extracción sea compleja. Las ARN son enzimas estables que funcionan sin ningún cofactor. Pequeñas cantidades de ARN son adecuadas para destruir el ARN. Cuando el tejido pancreático de rata se extrae de la cavidad abdominal, es necesario desinfectar los instrumentos quirúrgicos con detergentes fuertes, enjuagarlos bien y ponerlos en un horno durante al m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El presente estudio fue apoyado financieramente por la Universidad de Ciencias Médicas de Shiraz (Grant No. 93-01-01-7178-03-07-2014). Agradecemos al Sr. Zomorodian y al Sr. Rostami en el Departamento de e-Learning en Ciencias Médicas, Escuela Virtual y Centro de Excelencia en e-Learning, Universidad de Ciencias Médicas de Shiraz por editar el video.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
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