Extração rápida e econômica do RNA do tecido pancreático de rato
Summary
A pureza e integridade do RNA isolado é um passo vital nos ensaios dependentes do RNA. Aqui, apresentamos um método prático, rápido e barato para extrair RNA de uma pequena quantidade de tecido pancreático não danificado.
Abstract
Independentemente do método de extração, a extração otimizada de RNA de tecidos e linhas celulares é realizada em quatro estágios: 1) homogeneização, 2) desnaturação efetiva de proteínas de RNA, 3) inativação de ribonuclease e 4) remoção da contaminação do DNA, proteínas e carboidratos. No entanto, é muito trabalhoso manter a integridade do RNA quando há altos níveis de RNase no tecido. A autolise espontânea torna muito difícil extrair RNA do tecido pancreático sem danificá-lo. Assim, é necessário um método prático de extração de RNA para manter a integridade dos tecidos pancreáticos durante o processo de extração. Um estudo experimental e comparativo dos protocolos existentes foi realizado obtendo 20-30 mg de tecidos pancreáticos de ratos em menos de 2 minutos e extraindo o RNA. Os resultados foram avaliados por eletroforese. Os experimentos foram realizados três vezes para generalização dos resultados. A imersão do tecido pancreático no reagente de estabilização de RNA a -80 °C por 24 h rendeu RNA de alta integridade, quando o reagente de extração de RNA foi usado como reagente. Os resultados obtidos foram comparáveis aos resultados obtidos a partir de kits comerciais com as vinculações da coluna spin.
Introduction
Dados genéticos estruturais podem ser transcritos para um produto funcional através da expressão genética. A análise de RNA é usada para descobrir diferenças na expressão genética em diferentes condições. Existem uma série de métodos para extrair ácidos nucleicos da seguinte forma: tiocianato de guanidinium, extração via fenol-clorofórmio, cromatografia à base de celulose, extração por matrizes de sílica e troca deânion 1,,2.
A detecção adequada da expressão genética é influenciada pela integridade do RNA isolado dos tecidos; portanto, é vital avaliar a integridade do RNA isolado dos tecidos antes que novos testes sejam realizados, pois testes moleculares complementares em RNA de baixa qualidade podem comprometer os resultados da aplicação diagnóstica. Assim, o RNA de alta integridade é necessário para testes biológicos moleculares com diferentes aplicações diagnósticas: RT-PCR quantitativo, micro arrays, ensaio de proteção à ribonuclease, análise de manchas do norte, mapeamento de RNA e construção de biblioteca cDNA3,,4.
O RNA torna-se bastante instável depois de ser mantido por muito tempo. Fragmentos longos de mRNA acima de 10 kb são particularmente suscetíveis à degradação5,6. Assim, os pesquisadores devem considerar vários fatores que influenciam a integridade do RNA purificado. A pureza do RNA deve ser protegida contra RNases, proteínas, DNA genômico e contaminação inibidora enzimática. Além disso, a melhor e aceitável razão de absorção de RNA para UV (260/280) deve estar dentro da faixa de 1,8-2.0 com fragmentação mínima sobre a eletroforese. Técnicas laboratoriais recentemente desenvolvidas permitiram aos cientistas avaliar a integridade da amostra de análise molecular mais praticamente7,,8.
É muito mais difícil extrair RNA não danificado do tecido pancreático do que outros tipos de tecidos devido à alta quantidade de ribonucleases (RNases). Entretanto, os métodos de extração existentes, ou seja, a rápida ejeção do tecido pancreático da cavidade abdominal e a homogeneização a baixas temperaturas para impedir as RNases, provaram-se ineficazes7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,14.
O objetivo do presente estudo experimental comparativo é modificar e comparar os métodos existentes para determinar os métodos mais eficientes. Para isso, vários protocolos de extração de RNA foram modificados e comparados. O objetivo foi especificamente determinar o método mais barato que exige uma quantidade mínima de tecido pancreático.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na biologia molecular é vital obter RNA de alta qualidade. A presença das enzimas ribonuclease em células e tecidos rapidamente degrada o RNA e torna o complexo de extração. RNases são enzimas estáveis funcionando sem quaisquer cofatores. Pequenas quantidades de RNase são adequadas para destruir o RNA. Quando o tecido pancreático de rato é removido da cavidade abdominal, é necessário desinfetar os instrumentos cirúrgicos por detergentes fortes, enxaguar-os completamente e colocá-los em um forno por pelo men…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O presente estudo foi apoiado financeiramente pela Universidade shiraz de ciências médicas (Grant No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Agradecemos ao Sr. Zomorodian e ao Sr. Rostami no Departamento de e-Learning em Ciências Médicas, Escola Virtual e Centro de Excelência em e-Learning, Universidade shiraz de Ciências Médicas por editar o vídeo.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Dai, L. -. j. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, &. #. 1. 9. 3. ;. Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
