מיצוי RNA מהיר וחסכוני של רקמת הלבלב חולדה
Summary
הטוהר והיושרה של ה-RNA המבודד הוא צעד חיוני בהתלות RNA. כאן, אנו מציגים שיטה מעשית, מהירה וזולה כדי לחלץ RNA מכמות קטנה של רקמת הלבלב שלא ניזוקה.
Abstract
ללא קשר לשיטת החילוץ, מיצוי RNA אופטימיזציה של רקמות וקווי תאים מתבצעים בארבעה שלבים: 1) הומוגניזציה, 2) denaturization יעיל של חלבונים מ RNA, 3) אי-הפעלה ריבונוקלאז, ו 4) הסרת זיהום מ-DNA, חלבונים, ופחמימות. עם זאת, זה מאוד מייגע כדי לשמור על שלמות RNA כאשר יש רמות גבוהות של RNase ברקמה. Autolysis ספונטני עושה את זה קשה מאוד לחלץ RNA מרקמות הלבלב מבלי לפגוע בו. לכן, שיטת מיצוי RNA מעשית יש צורך לשמור על שלמות של רקמות הלבלב במהלך תהליך החילוץ. מחקר ניסיוני והשוותי של פרוטוקולים קיימים בוצע על ידי קבלת 20-30 מ”ג של רקמות הלבלב חולדה בפחות מ 2 דקות וחילוץ RNA. התוצאות הוערכו על ידי אלקטרופורזה. הניסויים בוצעו שלוש פעמים להכללת התוצאות. טבילה רקמת הלבלב בריאגנט ייצוב RNA ב -80 ° C עבור 24 שעות הניב RNA שלמות גבוהה, כאשר ריאגנט מיצוי RNA שימש כמו reagent. התוצאות שהתקבלו היו דומות לתוצאות שהתקבלו ערכות מסחריות עם איגודי עמודות ספין.
Introduction
ניתן לתעתק נתוני גנים מבניים למוצר פונקציונלי באמצעות ביטוי גנים. ניתוח RNA משמש לגילוי הבדלים בביטוי גנים בתנאים שונים. ישנן מספר שיטות לחלץ חומצות גרעין כדלקמן: גאנידיניום thiocyanate, חילוץ באמצעות פנול-כלורופורם, כרומטוגרפיה מבוססת תאית, מיצוי על ידי מטריצות סיליקה, ואניון-exchange1,,2.
זיהוי נכון של ביטוי גנים מושפע על ידי שלמות RNA מבודד מרקמות; לכן, זה חיוני כדי להעריך את שלמות RNA מבודד מרקמות לפני בדיקות נוספות מתבצעות כי בדיקות מולקולריות משלימות על RNA באיכות נמוכה עלול לסכן את תוצאות יישום אבחון. לכן, RNA שלמות גבוהה נדרש עבור בדיקות ביולוגיות מולקולריות עם יישומי אבחון שונים: RT-PCR כמותי, מיקרו-מערכים, אחסון הגנת ribonuclease, ניתוח כתם צפוני, מיפוי RNA, ובניית ספריית cDNA3,4.
RNA הופך להיות לא יציב למדי לאחר שהוחזק במשך זמן רב. שברי mRNA ארוכים מעל 10 kb רגישים במיוחד להשפלה5,6. לפיכך, על החוקרים לשקול גורמים שונים המשפיעים על שלמות ה-RNA המטוהר. הטוהר של RNA חייב להיות מוגן מפני RNases, חלבונים, DNA גנומי, וזיהום מעכב אנזימטי. בנוסף, יחס הספיגה הטוב והמקובל של RNA ל-UV (260/280) חייב להיות בטווח של 1.8-2.0 עם פיצול מינימלי על פני אלקטרופורזה. טכניקות מעבדה שפותחו לאחרונה אפשרו למדענים להעריך את שלמות מדגם הניתוח המולקולרייותר כמעט 7,8.
זה הרבה יותר קשה לחלץ RNA לא ניזוק מרקמות הלבלב מאשר סוגים אחרים של רקמות בגלל הכמות הגבוהה של ribonucleases (RNases). עם זאת, שיטות החילוץ הקיימות, כלומר פליטה מהירה של רקמת הלבלב מחלל הבטן והומוגניזציה בטמפרטורות נמוכות כדי לסתור RNases,הוכחו כלא יעילים 7, 8,9,,10,11,12,,13,14.9
מטרת המחקר הניסיוני ההשוואתי הנוכחי היא לשנות ולהשוות שיטות קיימות כדי לקבוע את השיטות היעילות ביותר. כך שונו והשוו פרוטוקולים שונים של חילוץ RNA. זה היה מכוון במיוחד כדי לקבוע את השיטה הפחות יקרה הדורשת כמות מינימלית של רקמת הלבלב.
Protocol
Representative Results
Discussion
בביולוגיה מולקולרית חיוני להשיג RNA באיכות גבוהה. הנוכחות של אנזימי ribonuclease בתאים ורקמות במהירות משפיל RNA והופך את החילוץ מורכב. RNases הם אנזימים יציבים מתפקדים ללא כל גורמים שונים. כמויות קטנות של RNase מספיקות כדי להרוס RNA. כאשר רקמת הלבלב חולדה מוסרת מחלל הבטן, יש צורך לחטא את כלי הניתוח על ידי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר הנוכחי נתמך כספית על ידי אוניברסיטת שיראז למדעי הרפואה (גרנט מס’ 93-01-01-7178/03-07-2014). אנו מודים למר זומורודיאן ולמר רוסתמי במחלקה ללמידה אלקטרונית במדעי הרפואה, בית הספר הווירטואלי והמרכז למצוינות בלמידה אלקטרונית, אוניברסיטת שיראז למדעי הרפואה על עריכת הסרטון.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Dai, L. -. j. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, &. #. 1. 9. 3. ;. Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
