Schnelle und kostengünstige RNA-Extraktion von Ratten-Pankreasgewebe
Summary
Die Reinheit und Integrität der isolierten RNA ist ein wichtiger Schritt in RNA-abhängigen Assays. Hier präsentieren wir eine praktische, schnelle und kostengünstige Methode, um RNA aus einer kleinen Menge unbeschädigtem Bauchspeicheldrüsengewebe zu extrahieren.
Abstract
Unabhängig von der Extraktionsmethode erfolgt die optimierte RNA-Extraktion von Geweben und Zelllinien in vier Stufen: 1) Homogenisierung, 2) effektive Denaturierung von Proteinen aus der RNA, 3) Ribonuklease-Inaktivierung und 4) Entfernung von Verunreinigungen aus DNA, Proteinen und Kohlenhydraten. Jedoch, Es ist sehr mühsam, die Integrität der RNA zu erhalten, wenn es hohe Niveaus von RNase im Gewebe. Die spontane Autolyse macht es sehr schwierig, RNA aus Bauchspeicheldrüsengewebe zu extrahieren, ohne sie zu beschädigen. Daher ist eine praktische RNA-Extraktionsmethode erforderlich, um die Integrität des Bauchspeicheldrüsengewebes während des Extraktionsprozesses zu erhalten. Eine experimentelle und vergleichende Untersuchung bestehender Protokolle wurde durchgeführt, indem 20-30 mg Bauchspeicheldrüsengewebe der Ratte in weniger als 2 Minuten erhalten und die RNA extrahiert wurden. Die Ergebnisse wurden durch Elektrophorese bewertet. Die Experimente wurden dreimal zur Verallgemeinerung der Ergebnisse durchgeführt. Das Eintauchen von Bauchspeicheldrüsengewebe in das RNA-Stabilisierungsreagenz bei -80 °C für 24 h ergab eine hochintegrierte RNA, als das RNA-Extraktionsreagenz als Reagenz verwendet wurde. Die erzielten Ergebnisse waren vergleichbar mit den Ergebnissen kommerzieller Kits mit Spinsäulenbindungen.
Introduction
Strukturelle Gendaten können durch Genexpression auf ein funktionelles Produkt übertragen werden. Die RNA-Analyse wird verwendet, um Unterschiede in der Genexpression zwischen verschiedenen Bedingungen zu entdecken. Es gibt eine Reihe von Methoden, um Nukleinsäuren wie folgt zu extrahieren: Guanidiniumthiocyanat, Extraktion über Phenol-Chlorform, Cellulose-basierte Chromatographie, Extraktion durch Kieselsäurematrizen und Anionenaustausch1,2.
Der richtige Nachweis der Genexpression wird durch die Integrität der aus Geweben isolierten RNA beeinflusst; Daher ist es wichtig, die Integrität der aus Geweben isolierten RNA zu bewerten, bevor weitere Tests durchgeführt werden, da ergänzende molekulare Tests an minderwertiger RNA die Ergebnisse der diagnostischen Anwendung gefährden können. Daher wird hochintegrierte RNA für molekularbiologische Tests mit verschiedenen diagnostischen Anwendungen benötigt: quantitative RT-PCR, Mikro-Arrays, Ribonuklease-Schutz-Assay, Nordfleckanalyse, RNA-Mapping und cDNA-Bibliothekskonstruktion3,4.
RNA wird ziemlich instabil, nachdem sie für eine lange Zeit gehalten wurde. Lange mRNA-Fragmente über 10 kb sind besonders anfällig für Abbau5,6. Daher müssen die Forscher verschiedene Faktoren berücksichtigen, die die Integrität der gereinigten RNA beeinflussen. Die Reinheit der RNA muss gegen RNasen, Proteine, genomische DNA und enzymatische Inhibitorkontamination geschützt werden. Darüber hinaus muss das beste und akzeptable Absorptionsverhältnis von RNA zu UV (260/280) im Bereich von 1,8-2,0 bei minimaler Fragmentierung über Elektrophorese liegen. Kürzlich entwickelte Labortechniken haben es Wissenschaftlern ermöglicht, die Integrität molekularer Analyseprobenpraktischerzu bewerten 7,8.
Es ist viel schwieriger, unbeschädigte RNA aus Bauchspeicheldrüsengewebe zu extrahieren als andere Gewebearten wegen der hohen Menge an Ribonukleasen (RNasen). Jedoch, bestehende Extraktionsmethoden, nämlich der schnelle Auswurf des Bauchspeicheldrüsengewebes aus der Bauchhöhle und Homogenisierung bei niedrigen Temperaturen, um RNases zu behindern, haben sich als ineffektiv7,8,9,10,11,12,13,14.
Der Zweck der vorliegenden vergleichenden experimentellen Studie besteht darin, bestehende Methoden zu modifizieren und zu vergleichen, um die effizientesten Methoden zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Protokolle der RNA-Extraktion modifiziert und verglichen. Es zielte speziell darauf ab, die am wenigsten teure Methode zu bestimmen, die eine minimale Menge an Bauchspeicheldrüsengewebe erfordert.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Molekularbiologie ist es wichtig, hochwertige RNA zu erhalten. Das Vorhandensein der Ribonuklease-Enzyme in Zellen und Geweben baut die RNA schnell aus und macht den Extraktionskomplex. RNasen sind stabile Enzyme, die ohne Co-Faktoren wirken. Kleine Mengen an RNase sind ausreichend, um RNA zu zerstören. Wenn das Bauchspeicheldrüsengewebe der Ratte aus der Bauchhöhle entfernt wird, ist es notwendig, die chirurgischen Instrumente mit starken Reinigungsmitteln zu desinfizieren, gründlich zu spülen und sie mindes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die vorliegende Studie wurde von der Shiraz University of Medical Sciences finanziell unterstützt (Grant-Nr. 93-01-01-7178-03-07-2014). Wir danken Herrn Zomorodian und Herrn Rostami am Department of e-Learning in Medical Sciences, Virtual School und Center of Excellence in e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences für die Bearbeitung des Videos.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
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