Snelle en kosteneffectieve RNA-extractie van rattenlelfum
Summary
De zuiverheid en integriteit van het geïsoleerde RNA is een essentiële stap in RNA-afhankelijke testen. Hier presenteren we een praktische, snelle en goedkope methode om RNA te extraheren uit een kleine hoeveelheid onbeschadigd alvleesklierweefsel.
Abstract
Ongeacht de extractiemethode worden geoptimaliseerde RNA-extractie van weefsels en cellijnen uitgevoerd in vier fasen: 1) homogenisatie, 2) effectieve denaturatie van eiwitten uit RNA, 3) ribonuclease-inactivatie en 4) verwijdering van besmetting uit DNA, eiwitten en koolhydraten. Het is echter zeer omslachtig om de integriteit van RNA te behouden wanneer er hoge niveaus van RNase in het weefsel zijn. Spontane autolyse maakt het erg moeilijk om RNA uit alvleesklierweefsel te extraheren zonder het te beschadigen. Zo is een praktische RNA-extractiemethode nodig om de integriteit van alvleesklierweefsels tijdens het extractieproces te behouden. Een experimentele en vergelijkende studie van bestaande protocollen werd uitgevoerd door het verkrijgen van 20-30 mg rattenvleesklierweefsels in minder dan 2 minuten en het extraheren van het RNA. De resultaten werden beoordeeld aan de hand van elektroforese. De experimenten werden uitgevoerd drie keer voor generalisatie van de resultaten. Het onderdompelen van alvleesklierweefsel in RNA-stabilisatiereagens bij -80 °C gedurende 24 uur leverde RNA met een hoge integriteit op, toen het RNA-extractiereagemiddel als reagens werd gebruikt. De verkregen resultaten waren vergelijkbaar met de resultaten van commerciële kits met spinkolombiningen.
Introduction
Structurele gengegevens kunnen worden getranscribeerd naar een functioneel product door middel van genexpressie. RNA-analyse wordt gebruikt om verschillen in genexpressie over verschillende omstandigheden te ontdekken. Er zijn een aantal methoden om nucleïnezuren als volgt te extraheren: guanidiniumthiocyanaat, extractie via fenol-chloroform, chromatografie op basis van cellulose, extractie door silicamatrices en anion-uitwisseling1,2.
De juiste detectie van genexpressie wordt beïnvloed door de integriteit van RNA geïsoleerd uit weefsels; daarom is het van essentieel belang om de integriteit van RNA geïsoleerd uit weefsels te evalueren voordat verdere tests worden uitgevoerd, omdat aanvullende moleculaire tests op RNA van lage kwaliteit diagnostische toepassingsresultaten in gevaar kunnen brengen. Zo is een hoge integriteit RNA nodig voor moleculaire biologische tests met verschillende diagnostische toepassingen: kwantitatieve RT-PCR, micro-arrays, ribonuclease beschermingstest, noordelijke vlekanalyse, RNA-mapping en cDNA-bibliotheekbouw3,4.
RNA wordt nogal instabiel na lange tijd te zijn gehouden. Lange mRNA-fragmenten van meer dan 10 kb zijn bijzonder gevoelig voor afbraak5,6. Zo moeten onderzoekers rekening houden met verschillende factoren die de integriteit van gezuiverd RNA beïnvloeden. De zuiverheid van RNA moet worden beschermd tegen RNases, eiwitten, genomisch DNA en enzymatische remmerbesmetting. Bovendien moet de beste en aanvaardbare absorptieverhouding van RNA tot UV (260/280) binnen het bereik van 1,8-2.0 liggen met minimale fragmentatie ten opzichte van elektroforese. Recent ontwikkelde laboratoriumtechnieken hebben wetenschappers in staat gesteld om de integriteit van moleculair analysemonster praktischer te evalueren7,8.
Het is veel moeilijker om onbeschadigd RNA uit alvleesklierweefsel te halen dan andere soorten weefsels vanwege de hoge hoeveelheid ribonucleases (RNases). De bestaande extractiemethoden, namelijk de snelle uitwerping van het alvleesklierweefsel uit de buikholte en homogenisatie bij lage temperaturen om RNases te belemmeren , hebben echter ineffectiefgebleken 7,8,,9,10,11,12,13,14.
Het doel van deze vergelijkende experimentele studie is het wijzigen en vergelijken van bestaande methoden om de meest efficiënte methoden te bepalen. Daartoe werden verschillende protocollen van RNA-extractie gewijzigd en vergeleken. Het was specifiek gericht op het bepalen van de minst dure methode die een minimale hoeveelheid pancreasweefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de moleculaire biologie is het van vitaal belang om RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen. De aanwezigheid van de ribonuclease enzymen in cellen en weefsels degradeert snel RNA en maakt de extractie complex. RNases zijn stabiele enzymen die functioneren zonder mede-factoren. Kleine hoeveelheden RNase zijn voldoende om RNA te vernietigen. Wanneer het alvleesklierweefsel van de rat uit de buikholte wordt verwijderd, is het noodzakelijk om de chirurgische instrumenten te desinfecteren met sterke detergenten, ze grondig af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De huidige studie werd financieel ondersteund door de Shiraz University of Medical Sciences (Grant No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Wij danken de heer Zomorodian en de heer Rostami op het departement e-Learning in medische wetenschappen, Virtuele School en Center of Excellence in e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences voor het bewerken van de video.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Dai, L. -. j. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, &. #. 1. 9. 3. ;. Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
