استخراج RNA سريع وفعال من حيث التكلفة من أنسجة البنكرياس الجرذ
Summary
نقاء وسلامة الجيش الملكي النيبالي المعزول هو خطوة حيوية في اختبار الحمض النووي الريبي تعتمد. هنا، نقدم طريقة عملية وسريعة وغير مكلفة لاستخراج الحمض النووي الريبي من كمية صغيرة من أنسجة البنكرياس غير التالفة.
Abstract
بغض النظر عن طريقة الاستخراج، يتم استخراج الحمض النووي الريبي الأمثل من الأنسجة وخطوط الخلايا في أربع مراحل: 1) التجانس، 2) denaturation فعالة من البروتينات من الجيش الملكي النيبالي، 3) ريبونوكيليشنيشن، و 4) إزالة التلوث من الحمض النووي، والبروتينات، والكربوهيدرات. ومع ذلك، فمن شاق جدا للحفاظ على سلامة الجيش الملكي النيبالي عندما تكون هناك مستويات عالية من RNase في الأنسجة. التلقائي التلقائي يجعل من الصعب جداً استخراج الحمض النووي الريبي من أنسجة البنكرياس دون الإضرار به. وهكذا، هناك حاجة إلى طريقة عملية استخراج الحمض النووي الريبي للحفاظ على سلامة أنسجة البنكرياس أثناء عملية الاستخراج. أجريت دراسة تجريبية ومقارنة للبروتوكولات الموجودة عن طريق الحصول على 20-30 ملغ من أنسجة البنكرياس الفئران في أقل من 2 دقيقة واستخراج RNA. تم تقييم النتائج بواسطة الكهرباء. وأجريت التجارب ثلاث مرات لتعميم النتائج. غمر أنسجة البنكرياس في مُستفد تثبيت الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية لـ 24 ساعة أثمرت RNA عالية النزاهة، عندما تم استخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي كمكاد للكاشف. وكانت النتائج التي تم الحصول عليها مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها من مجموعات المواد التجارية مع ربط عمود الدوران.
Introduction
يمكن نسخ البيانات الجينية الهيكلية إلى منتج وظيفي من خلال التعبير الجيني. يستخدم تحليل الحمض النووي الريبي لاكتشاف الاختلافات في التعبير الجيني عبر ظروف مختلفة. هناك عدد من الطرق لاستخراج الأحماض النووية على النحو التالي: الثيوسيانات guanidinium، والاستخراج عن طريق الفينول- الكلوروفورم، والكرومات القائم على السليلوز، واستخراج بواسطة مصفوفات السيليكا، وتبادل الأنيون1،2.
ويتأثر الكشف السليم عن التعبير الجيني بسلامة الحمض النووي الريبي المعزول عن الأنسجة؛ ولذلك، فمن الأهمية بمكان لتقييم سلامة الحمض النووي الريبي معزولة عن الأنسجة قبل إجراء مزيد من الاختبارات لأن الاختبارات الجزيئية التكميلية على RNA منخفضة الجودة قد تعرض للخطر نتائج التطبيق التشخيصي. وهكذا، هناك حاجة إلى RNA سلامة عالية للاختبارات البيولوجية الجزيئية مع تطبيقات التشخيص المختلفة: كمية RT-PCR، صفائف صغيرة، مقايسة حماية ribonuclease، تحليل البقعة الشمالية، رسم خرائط الحمض النووي الريبي، وبناء مكتبة cDNA3،4.
RNA يصبح غير مستقر نوعا ما بعد أن يتم الاحتفاظ بها لفترة طويلة. شظايا مرنا طويلة أكثر من 10 كيلو بايت عرضة بشكل خاص للتدهور5،6. وبالتالي، يجب على الباحثين النظر في مختلف العوامل التي تؤثر على سلامة الحمض النووي الريبي المنقى. يجب حماية نقاء الحمض النووي الريبي ضد RNases والبروتينات والحمض النووي الجينومي والتلوث المثبط الأنزيمي. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون نسبة امتصاص أفضل ومقبولة من الحمض النووي الريبي إلى الأشعة فوق البنفسجية (260/280) ضمن نطاق 1.8-2.0 مع الحد الأدنى من التشظي على الكهرباء. وقد مكنت التقنيات المختبرية التي وضعت مؤخرا العلماء لتقييم سلامة عينة التحليل الجزيئي أكثر عمليا7،8.
ومن الصعب استخراج الحمض النووي الريبي غير التالفة من أنسجة البنكرياس من أنواع أخرى من الأنسجة بسبب كمية عالية من ريبونوكليس (RNases). ومع ذلك ، فإن طرق الاستخراج الحالية ، وهي القذف السريع للأنسجة البنكرياسية من تجويف البطن والتجانس في درجات حرارة منخفضة لإعاقة RNases ، أثبتت أنها غير فعالة7،8،9،10،11،12،13،14.
والغرض من هذه الدراسة التجريبية المقارنة هو تعديل ومقارنة الأساليب القائمة لتحديد أكثر الطرق كفاءة. وتحقيقا لتلك الغاية، تم تعديل بروتوكولات مختلفة لاستخراج الحمض النووي الريبي ومقارنتها. وكان الهدف منها على وجه التحديد هو تحديد الطريقة الأقل تكلفة التي تتطلب الحد الأدنى من أنسجة البنكرياس.
Protocol
Representative Results
Discussion
في البيولوجيا الجزيئية من المهم الحصول على RNA عالية الجودة. وجود الإنزيمات ريبونوكليز في الخلايا والأنسجة سرعان ما يتحلل الجيش الملكي النيبالي ويجعل عملية الاستخراج معقدة. RNases هي الإنزيمات مستقرة تعمل دون أي عوامل. كميات صغيرة من RNase كافية لتدمير الجيش الملكي النيبالي. عندما تتم إزالة أنس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم مالي من جامعة شيراز للعلوم الطبية (منحة رقم 93-01-01-7178\03-07-2014). نشكر السيد زوموروديان والسيد رستمي في قسم التعليم الإلكتروني في العلوم الطبية، والمدرسة الافتراضية ومركز التميز في التعليم الإلكتروني، جامعة شيراز للعلوم الطبية لتحرير الفيديو.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Dai, L. -. j. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, &. #. 1. 9. 3. ;. Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
