Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon
Summary
Bu yöntem, Caenorhabditis elegans örneklerinden ve daha sonra eş-immünoselipitasyondan yüksek verimli protein özü hazırlanması için bir protokol açıklar.
Abstract
Protein-protein etkileşimlerini incelemek için sıklıkla ko-immünoselipitasyon yöntemleri kullanılmaktadır. Hipotezlenmiş protein-protein etkileşimlerinin onaylanması veya yenilerinin tanımlanması, ilgi çekici bir proteinin işlevi hakkında paha biçilmez bilgiler sağlayabilir. Ekstrakt hazırlama için geleneksel yöntemlerden bazıları sıklıkla emek yoğun ve zaman alıcı teknikler gerektirir. Burada, boncuk değirmeni homojenizatörü ve metal boncuklar kullanılarak değiştirilmiş bir ekstrakt hazırlama protokolü, geleneksel protein hazırlama yöntemlerine hızlı bir alternatif olarak tanımlanmaktadır. Bu ekstrakt hazırlama yöntemi aşağı akış eş-immüno-immün önksepitasyon çalışmaları ile uyumludur. Örnek olarak, yöntem C. elegans mikroRNA Argonaute ALG-1 ve bilinen iki ALG-1 interactor’u başarıyla eş-immünprecipitate etmek için kullanıldı: AIN-1 ve HRPK-1. Bu protokol, hayvan örneği toplama, ekstrakt hazırlama, ekstrakt açıklama ve protein immün önseçiminin açıklamalarını içerir. Açıklanan protokol, çeşitli genetik geçmişlerde iki veya daha fazla endojen, endojen olarak etiketlenmiş veya aşırı ifade edilmiş C. elegans proteinleri arasındaki etkileşimleri test etmek için uyarlanabilir.
Introduction
İlgi çekici bir proteinin makromoleküler etkileşimlerini tanımlamak, işlevi hakkında daha fazla bilgi edinmenin anahtarı olabilir. İmmün prempripitasyon ve eş-immünovipitasyon deneyleri, büyük ölçekli proteomik yaklaşımlar1 yoluyla bir proteinin tüm etkileşimini tanımlamak veya bir proteinin hipotezlenmiş bir interactor ile işbirliği yapma yeteneğini özellikle test etmek için kullanılabilir. C. elegans‘da, gen ekspresyonunu düzenlemek için mikroRNA’larla yakından çalışan proteinler de dahil olmak üzere çeşitli proteinlerin aktivitesi hakkında daha fazla bilgi edinmek için her iki yöntem de başarıyla 2,3,4. Ortak immün premünipitasyon deneyleri, protein-protein etkileşimlerini kendi doğal hücresel ortamlarında test etme avantajına sahiptir, ancak ekstrakt hazırlama zor ve zaman alıcı olabilir. Numunenin verimli lizisi gereklidir, ancak protein-protein etkileşimlerinin bozulmasını en aza indirmek için dikkatli olunmalıdır. C. elegans toplam protein özlerini başarıyla hazırlamak için5,sonication6, Balch homojenizasyon7ve zirkonya boncukları-homojenizasyon8,9 gibi yöntemler kullanılmıştır. Bu yöntemler, zirkonya boncuk homojenizasyonu dışında, aynı anda işlenebilen numune sayısı açısından sınırlamalara sahiptir. Sunulan, C. elegans örneklerinden yüksek verimli, hızlı protein özü hazırlanmasına izin vermek için kolayca ölçeklendirilebilen alternatif biryöntemdir. Özellikle, yöntem aynı anda 24 numune hazırlayabilir ve ekstrakt hazırlığı için gereken süreyi büyük ölçüde azaltabilir. Bunun aksine, örneğin, douncing genellikle aynı anda yalnızca bir örnek hazırlamaya izin verir. Bu ekstrakt yöntemi, C. elegans’ınherhangi bir gelişim aşamasından özler hazırlamak için kullanılabilir.
Açıklanan, başarılı protein çekme ve ortak immün önseçimli proteinin tespitini doğrulamak için hayvan örneği toplama, ekstrakt hazırlama, immün önseçimleme ve Batı şişkinlik verilerinin sunumu için adım adım bir prosedürdür. Protokolün etkinliğini göstermek için, 1) microRNA Argonaute ALG-1 ve GW182 homolog olan AIN-1 arasında iki ortak immün önseçim deneyi yapıldı; ve 2) ALG-1 ve HRPK-1, yeni tanımlanmış bir ALG-1 interactor2. ALG-1 ve AIN-1, mikroRNA kaynaklı susturma kompleksini (miRISC) oluşturan temel proteinlerdir ve bu iki protein arasındaki etkileşim iyi belirlenmiştir10,11. Ekstrakt hazırlama protokolü ALG-1-AIN-1 eş-immünoselipitasyon deneyinde etkili oldu. Bu protokol ayrıca ALG-1 ve yeni tanımlanan etkileşimcisi HRPK-12arasındaki etkileşimi başarıyla doğruladı.
Özetle, makale, proteinler arasındaki yeni veya hipotez etkileşimleri tanımlamak veya doğrulamak için kullanılabilecek bir eş-immün özürlülük protokolü ile birlikte 24 örneği aynı anda işlemek için ölçeklendirilebilen bir C. elegans özü hazırlama protokolünü tanımlamaktadır. Ekstrakt hazırlama protokolü, protein immün önkeksasyonu2 ve mikroRNA çekmeleri12dahil olmak üzere bir dizi aşağı akış deneyi ile uyumludur. Ayrıca, immün önksezi protokolü, çeşitli genetik geçmişlerde iki veya daha fazla endojen, endojen olarak etiketlenmiş veya aşırı ifade edilmiş C. elegans proteinleri arasındaki etkileşimleri test etmek için uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans hücre, moleküler ve gelişim biyolojislerindeki temel soruları incelemek için mükemmel bir modeldir19. Genetik bir model sistemi olarak gücüne ek olarak, C. elegans protein immüno-immün önseçim ve eş-immünoselipitasyon dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere biyokimyasal yaklaşımlara açıktır. İmmün prempripitasyon deneyleri yaparken olası bir engel, ilgi proteinlerine özgü antikorların eksikliğidir. Antikor yoksa özel poliklonal veya monoklonal antikorlar üretilebilir. Bununla birlikte, genom düzenleme teknolojisindeki son yenilikler, araştırmacıların mutasyonları hızla tanıtmasına veya endojen C. elegans genlerini etiketlemesine izinvermiştir 20,21, genler ve kodlanmış proteinler arasındaki genetik, fonksiyonel ve fiziksel etkileşimleri çözen çalışmaları kolaylaştırmaktadır. Özellikle, CRISPR/Cas9 aracılı sonojen loci’deki C. elegans genlerinin etiketlenmesi, immün önseçim deneylerinin antikor kullanılabilirliği üzerindeki bağımlılığını azaltarak, eş-immün özürlülüğü deneylerini çok daha uygulanabilir hale getirdi. C. elegans genleri, GFP veya mCherry gibi floresan etiketlerden FLAG ve HA gibi küçük etiketlere kadar çeşitli etiketlerle etiketlenebilir. Bu etiketleri tanıyan antikorlar ticari olarak kolayca kullanılabilir ve immün önkupseleme yaklaşımları yoluyla protein-protein etkileşimlerinin çalışmalarını kolaylaştırır.
Şekil 1’deözetlenen sunulan protokol, az sayıda numune için gerçekleştirilebilir veya ölçeklendirilebilir ve aynı anda 24 numune hazırlığına izin verir. İmmün önseçme yoluyla protein-protein etkileşimlerinin ilk nitelemeleri tipik olarak normal büyüme koşulları altında vahşi tip arka planlarda yapılırken, takip çalışmaları genellikle protein-protein etkileşimlerinin çeşitli genetik arka planlarda veya farklı büyüme koşullarında test edilmesini gerektirir. Aynı anda birden fazla ekstrakt hazırlama yeteneği zaman kazandırır ve daha da önemlisi, farklı numuneler arasında ekstrakt hazırlama tutarlılığı sağlar. Negatif bir kontrol her zaman gereklidir, ideal kontrol, immün önkoşüle edilmiş ilgi proteini için gen kodlamasında boş bir mutasyondur (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4 örnek olarak).
Bu ekstrakt protokolü, C. elegans örneklerinden hızlı protein özü hazırlanmasına izin verir ve zirkonyum boncuk bazlı homojenizasyon8ile karşılaştırılabilir. Genel olarak boncuk homojenizasyonu, çeşitli boncuk değirmeni homojenizatörleri veya benzeri ekipmanlar kullanılarak birden fazla eşzamanlı numune preparatlarına kadar ölçeklendirilebilir. Bununla birlikte, bazı daha ekonomik boncuk değirmeni homojenizatörleri aynı anda işlenebilen numune sayısını azaltabilir. Alternatif olarak, sunulan ekstrakt protokolü, ekonomik bir alternatifi temsil eden dounce bazlı ekstrakt hazırlığı ile uyumludur. Farklı boncuk değirmeni homojenizatörleri test edilmede de, C. elegans örneklerinin tamamen bozulması sağlandığınız sürece, çoğu bu protein özü protokolü ile uyumlu olabilir.
Sunulduğu gibi, bu ekstrakt hazırlama protokolü, protein immünoselipitasyon2 ve microRNA aşağı çekme12 dahil olmak üzere birden fazla aşağı akış deneyi ile uyumludur ve hem protein hem de RNA bileşenlerinin aşağı akış toplanmasına izin verir. Ayrıca hem nükleer hem de sitoplazmik proteinleri verimli bir şekilde çıkarır (Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4). Benzer şekilde, sunulan immünoprecipitasyon protokolü protein ilişkili immünödepitaitlerden RNA izolasyonuna izin eder. İmmün önkekseleme protokolü başlangıçta ALG-1 protein etkileşimcilerini tanımlamak için geliştirilmiş olsa da, yöntem ilgi çekici proteinler arasındaki etkileşimleri test etmek için uyarlanabilir. Aslında, kullanılan immün prempripipitasyon koşulları ALG-1 (Şekil 3) ve HRPK-1 (Şekil 4)immünoprecipitasyon için eşit derecede iyi çalıştı. Bu protokol, RNA bağlayıcı proteinlerin immünpurifikasyonu için mükemmel bir başlangıç noktasıdır. Bununla birlikte, diğer ilgi proteinleri için tampon bileşiminde bazı değişikliklerin gerekli olabileceği belirtilmelidir. Değişiklikler, ilgi çekici proteinin fiziksel ve biyokimyasal özelliklerine bağlı olabilir ve duruma göre uygulanmalıdır.
Hedef protein (burada, ALG-1 veya HRPK-1) immün premünipit hale geldikten sonra, Batı şişkinliği belirli protein etkileşimcileri için ko-immünoprecipitate’i test etmek için kullanılabilir.
Alternatif olarak, kopurified immünprecipitate tüm putatif etkileşim proteinlerini tanımlamak için kütle spektrometresi analizine tabi tutulabilir. Doğrulanmış eş-immün özürlü etkileşimler daha sonra belirli etkileşimin potansiyel düzenlemesini belirlemek için çeşitli genetik geçmişlerde veya koşullarda incelenebilir. Örneğin, HRPK-1’in ALG-1/AIN-1 miRISC derlemesinde rol oynayıp oynamadığını belirlemek için, ALG-1-AIN-1 coprecipitation hem vahşi tip arka planda hem de HRPK-1 yokluğunda değerlendirildi (Şekil 3). hrpk-1’in ALG-1/AIN-1etkileşimi 2 (Şekil 3)için dağıtılabilir olduğu bulunmuştur. Ek olarak, CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi, ilgi çekici proteinlerde tek nokta veya alan adı silme mutasyonları oluşturmak için kullanılabilir. Üretilen mutantların protein etkileşimcileriyle işbirliği yapma yeteneğini yeniden test etmek, hangi etki alanlarının veya kalıntıların fiziksel etkileşime aracılık ettiğini ortaya açabilir. Bu tür gelecekteki çalışmalar, protein fonksiyonu ve regülasyon mekanizması hakkında paha biçilmez bilgiler verebilir. Bu yaklaşımlar, C. elegans genetiğinin gücü ile birlikte, hayvan gelişimini ve hücresel işlevi yöneten temel moleküler süreçler hakkında önemli içgörüler sağlayabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Kansas INBRE, Li ve Zinovyeva’ya P20GM103418 ve Zinovyeva’ya R35GM124828 tarafından desteklendi. Min Han’a anti-AIN-1 antikorlarını cömertçe paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma boyunca kullanılan suşların bir kısmı NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
References
- Liu, X., et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).
- Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development. PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).
- Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).
- Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans. Cell. 136 (5), 926-938 (2009).
- Zou, Y., et al. Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers. Science. 340 (6130), 372-376 (2013).
- Zanin, E., Dumont, J., et al. Affinity purification of protein complexes in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).
- Kohl, K., et al. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).
- Larance, M., Bailly, A. P., et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).
- Ding, L., Han, M. GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing. Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).
- Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans. Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).
- Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices. Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression. PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).
- Zhang, L., et al. Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2. Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Farboud, B., et al. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
