Preparação e Co-imunoprecipitação de Caenorhabditis elegans
Summary
Este método descreve um protocolo para a preparação de extratos de proteína de alto rendimento de amostras de elegans de Caenorhabditis e posterior co-imunoprecipitação.
Abstract
Métodos de co-imunoprecipitação são frequentemente usados para estudar interações proteína-proteína. A confirmação de interações proteína-proteínas hipotéticas ou a identificação de novas podem fornecer informações inestimáveis sobre a função de uma proteína de interesse. Alguns dos métodos tradicionais de preparação de extratos frequentemente requerem técnicas intensivas em mão-de-obra e demoradas. Aqui, um protocolo de preparação de extratos modificados usando um homogeneizador de moinho de contas e contas metálicas é descrito como uma alternativa rápida aos métodos tradicionais de preparação de proteínas. Este método de preparação do extrato é compatível com estudos de co-imunoprecipitação a jusante. Como exemplo, o método foi usado para co-imunoprecipitar com sucesso C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 e dois interagidores alg-1 conhecidos: AIN-1 e HRPK-1. Este protocolo inclui descrições da coleta de amostras de animais, preparação de extratos, esclarecimento de extratos e imunoprecipitação proteica. O protocolo descrito pode ser adaptado para testar interações entre quaisquer duas ou mais proteínas endógenas, marcadas endógenamente ou superexpressas em uma variedade de origens genéticas.
Introduction
Identificar as interações macromoleculares de uma proteína de interesse pode ser a chave para aprender mais sobre sua função. Experimentos de imunoprecipitação e co-imunoprecipitação podem ser usados para identificar todo o interactome de uma proteína através de abordagens proteômicas em larga escala1 ou para testar especificamente a capacidade de uma proteína de coprecipitar com um interagidor hipotético. Em C. elegans,ambos os métodos foram empregados com sucesso para aprender mais sobre a atividade de uma variedade de proteínas, incluindo aquelas que funcionam de perto com microRNAs para regular a expressão genética2,3,4. Experimentos de co-imunoprecipitação têm a vantagem de testar as interações proteína-proteína em seu ambiente celular nativo, mas a preparação do extrato pode ser desafiadora e demorada. A lise eficiente da amostra é necessária, mas deve-se tomar cuidado para minimizar a interrupção das interações proteína-proteína. Métodos como douncing5, sonication6, Balch homogenization7, e zircônia beads-homogeneization8,9 têm sido usados para preparar com sucesso extratos totais de proteínas C. elegans. Esses métodos, com exceção da homogeneização da conta de zircônia, têm limitações em termos do número de amostras que podem ser processadas simultaneamente. Apresentado é um método alternativo que pode ser facilmente dimensionado para permitir a preparação de extratos de proteínas rápidas e de alta produtividade de C. elegans seguidos de co-imunoprecipitação. Especificamente, o método pode preparar até 24 amostras por vez, reduzindo consideravelmente o tempo necessário para a preparação do extrato. Em contraste, por exemplo, douncing normalmente permite apenas uma preparação amostral por vez. Este método extrato pode ser usado para preparar extratos de qualquer estágio de desenvolvimento de C. elegans.
Descrito é um procedimento passo-a-passo para coleta de amostras de animais, preparação de extratos, imunoprecipitação e apresentação de dados de manchas ocidentais para confirmar a retirada e detecção bem sucedida da proteína co-imunoprecipitante de interesse. Para demonstrar a eficácia do protocolo, foram realizados dois experimentos de co-imunoprecipitação entre 1) microRNA Argonaute ALG-1 e AIN-1, um homólogo GW182; e 2) ALG-1 e HRPK-1, um recém-identificado interagedor ALG-12. ALG-1 e AIN-1 são proteínas centrais que compõem o complexo de silenciamento induzido pelo microRNA (miRISC) e a interação entre essas duas proteínas é bem estabelecida10,11. O protocolo de preparação do extrato foi eficaz no experimento de co-imunoprecipitação ALG-1-AIN-1. Este protocolo também confirmou com sucesso a interação entre a ALG-1e seu recém-identificado interager, HRPK-12 .
Em resumo, o manuscrito descreve um protocolo de preparação de extrato de C. elegans que pode ser dimensionado para processar simultaneamente 24 amostras, juntamente com um protocolo de co-imunoprecipitação que pode ser usado para identificar novas ou confirmar interações hipotéticas entre proteínas. O protocolo de preparação do extrato é compatível com uma série de experimentos a jusante, incluindo imunoprecipitaçãoproteica 2 e pulldowns microRNA12. Além disso, o protocolo de imunoprecipitação pode ser adaptado para testar interações entre quaisquer duas ou mais proteínas endógenas, marcadas ou superexpressas em uma variedade de origens genéticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans é um excelente modelo para estudar questões fundamentais em biologia celular, molecular e de desenvolvimento19. Além de seu poder como um sistema de modelo genético, C. elegans é favorável a abordagens bioquímicas, incluindo, mas não se limitando a, imunoprecipitação proteica e co-imunoprecipitação. Um obstáculo potencial na realização de experimentos de imunoprecipitação é a falta de anticorpos específicos às proteínas de interesse. Se nenhum anticorpo estiver disponível, podem ser gerados anticorpos policlonais ou monoclonais personalizados. No entanto, as recentes inovações na tecnologia de edição de genomas permitiram aos pesquisadores introduzir rapidamente mutações ou marcar genes endógenos C. elegans 20,21, facilitando estudos que desvendam as interações genéticas, funcionais e físicas entre os genes e as proteínas codificadas. Especificamente, a marcação mediada por CRISPR/Cas9 de genes C. elegans no loci endógeno reduziu a dependência de experimentos de imunoprecipitação na disponibilidade de anticorpos, tornando os experimentos de co-imunoprecipitação muito mais viáveis. C. elegans genes podem ser marcados com uma variedade de tags que vão desde tags fluorescentes como GFP ou mCherry até pequenas tags como FLAG e HA. Os anticorpos que reconhecem essas etiquetas estão prontamente disponíveis comercialmente, facilitando os estudos de interações proteína-proteína através de abordagens de imunoprecipitação.
O protocolo apresentado, delineado na Figura 1,pode ser realizado para um pequeno número de amostras ou ampliado, permitindo até 24 preparações amostrais por vez. Embora as caracterizações iniciais de interações proteína-proteína via imunoprecipitação sejam tipicamente feitas em origens do tipo selvagem em condições normais de crescimento, estudos de acompanhamento frequentemente exigem testar as interações proteína-proteína em uma variedade de origens genéticas ou em diferentes condições de crescimento. A capacidade de preparar simultaneamente vários extratos economiza tempo e, importante, garante a consistência de preparação do extrato entre as diferentes amostras. Um controle negativo é sempre necessário, com o controle ideal sendo uma mutação nula na codificação genética para a proteína imunoprecipitada de interesse (Ver Figura 3 e Figura 4, por exemplo).
Este protocolo de extrato permite a preparação rápida do extrato de proteínas a partir de amostras de C. elegans e é comparável à homogeneização à base de contas de zircônio8. A homogeneização das contas em geral pode ser dimensionada até múltiplas preparações simultâneas de amostras usando uma variedade de homogeneizadores de moinhos de contas ou equipamentos similares. Alguns homogeneizadores mais econômicos da fábrica de contas podem reduzir o número de amostras que podem ser processadas simultaneamente, no entanto. Alternativamente, o protocolo de extrato apresentado é compatível com a preparação do extrato à base de dounce, que representa uma alternativa econômica. Embora diferentes homogeneizadores de moinhos de contas não tenham sido testados, a maioria provavelmente será compatível com este protocolo de extrato de proteína, desde que a interrupção completa das amostras de C. elegans seja alcançada.
Como apresentado, este protocolo de preparação de extratos é compatível com múltiplos experimentos a jusante, incluindo imunoprecipitação proteica2 e microRNA pull-down12 e permite a coleta a jusante de componentes de proteína e RNA. Também extrai eficientemente proteínas nucleares e citoplasmáticas(Figura 2, Figura 3e Figura 4). Da mesma forma, o protocolo de imunoprecipitação apresentado permite o isolamento do RNA de imunoprecipitatos associados à proteína. Embora o protocolo de imunoprecipitação tenha sido originalmente desenvolvido para identificar os interagedores de proteínas ALG-1, o método pode ser adaptado para testar interações entre quaisquer proteínas de interesse. De fato, as condições de imunoprecipitação utilizadas funcionaram igualmente bem para imunoprecipitação ALG-1 (Figura 3) e HRPK-1 (Figura 4). Este protocolo é um excelente ponto de partida para a imunopurização de proteínas de ligação de RNA. Deve-se notar, no entanto, que algumas mudanças na composição do buffer podem ser necessárias para outras proteínas de interesse. As alterações podem depender das propriedades físicas e bioquímicas da proteína de interesse e devem ser implementadas caso a caso.
Uma vez que a proteína alvo (aqui, ALG-1 ou HRPK-1) é imunoprecipitada, a mancha ocidental pode ser usada para testar o co-imunoprecipitato para interagidores específicos de proteínas.
Alternativamente, o imunoprecipitato copurificado pode ser submetido à análise de espectrometria de massa para identificar todas as proteínas interativas putativas. Interações confirmadas de co-imunoprecipitação podem então ser examinadas em uma variedade de origens genéticas ou condições para identificar a possível regulação da interação específica. Por exemplo, para determinar se o HRPK-1 desempenha um papel na montagem ALG-1/AIN-1 miRISC, a coprecipitação ALG-1-AIN-1 foi avaliada tanto em um fundo tipo selvagem quanto na ausência de HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 foi considerado dispensável para interação ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Além disso, a tecnologia de edição de genomas CRISPR/Cas9 pode ser empregada para gerar mutações de exclusão de ponto único ou domínio nas proteínas de interesse. Retestar a capacidade dos mutantes gerados de coprecipitar com seus interajadores de proteínas pode revelar quais domínios ou resíduos mediam a interação física. Tais estudos futuros podem produzir informações inestimáveis sobre o mecanismo da função e regulação da proteína. Essas abordagens, combinadas com o poder da genética C. elegans, podem fornecer insights importantes sobre os processos moleculares fundamentais que regem o desenvolvimento animal e a função celular.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi em parte apoiado por Kansas INBRE, P20GM103418 para Li e Zinovyeva e R35GM124828 para Zinovyeva. Agradecemos a Min Han por compartilhar generosamente o anticorpo anti-AIN-1. Algumas das cepas utilizadas no decorrer deste trabalho foram fornecidas pelo Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC), financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
References
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