Questo metodo descrive un protocollo per la preparazione di estratti proteici ad alta produttività da campioni di caenorhabditis elegans e successiva co-immunoprecipitazione.
I metodi di co-immunoprecipitazione sono spesso usati per studiare le interazioni proteina-proteina. La conferma delle interazioni proteina-proteina ipotizzate o l’identificazione di nuove possono fornire informazioni inestimabili sulla funzione di una proteina di interesse. Alcuni dei metodi tradizionali per la preparazione degli estratti richiedono spesso tecniche ad alta intensità di manodopera e dispendiose in termini di tempo. Qui, un protocollo di preparazione degli estratti modificato che utilizza un omogeneizzatore per mulini perline e perline metalliche è descritto come una rapida alternativa ai metodi tradizionali di preparazione delle proteine. Questo metodo di preparazione dell’estratto è compatibile con studi di co-immunoprecipitazione a valle. Ad esempio, il metodo è stato utilizzato per co-immunoprecipitato con successo C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 e due interattori ALG-1 noti: AIN-1 e HRPK-1. Questo protocollo include descrizioni della raccolta dei campioni animali, della preparazione degli estratti, della chiarificazione dell’estratto e dell’immunoprecipitazione proteica. Il protocollo descritto può essere adattato per testare le interazioni tra due o più proteine endogene, taggate endogenamente o sovraespresse di C. elegans in una varietà di background genetici.
Identificare le interazioni macromolecolari di una proteina di interesse può essere la chiave per saperne di più sulla sua funzione. Gli esperimenti di immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione possono essere utilizzati per identificare l’intero interamome di una proteina attraverso approcci proteomici sularga scala 1 o per testare specificamente la capacità di una proteina di coprecipitate con un interagente ipotizzato. In C. elegans, entrambi i metodi sono stati utilizzati con successo per saperne di più sull’attività di una varietà di proteine, comprese quelle che funzionano strettamente con i microRNA perregolare l’espressione genica 2,3,4. Gli esperimenti di co-immunoprecipitazione hanno il vantaggio di testare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente cellulare nativo, ma la preparazione degli estratti può essere impegnativa e dispendiosa in termini di tempo. È necessaria un’analisi efficiente del campione, ma bisogna fare attenzione a ridurre al minimo l’interruzione delle interazioni proteina-proteina. Metodi come il douncing5, la sonicazione6,l’omogeneizzazione balch7e l’omogeneizzazione delle perline di zirconia8,9 sono stati utilizzati per preparare con successo gli estratti proteici totali di C. elegans. Questi metodi, ad eccezione dell’omogeneizzazione delle perline di zirconia, hanno limitazioni in termini di numero di campioni che possono essere elaborati contemporaneamente. Presentato è un metodo alternativo che può essere facilmente scalato per consentire una preparazione rapida ad alto contenuto di produzione e estratto proteico da campioni di C. elegans seguita da co-immunoprecipitazione. In particolare, il metodo può preparare fino a 24 campioni alla volta, riducendo notevolmente il tempo necessario per la preparazione dell’estratto. Al contrario, ad esempio, il douncing in genere consente una sola preparazione del campione alla volta. Questo metodo di estrazione può essere utilizzato per preparare estratti da qualsiasi stadio di sviluppo di C. elegans.
Descritto è una procedura dettagliata per la raccolta di campioni animali, la preparazione degli estratti, l’immunoprecipitazione e la presentazione dei dati western di soffiatura per confermare il successo del pulldown proteico e il rilevamento della proteina co-immunoprecipitante di interesse. Per dimostrare l’efficacia del protocollo, sono stati eseguiti due esperimenti di co-immunoprecipitazione tra 1) microRNA Argonaute ALG-1 e AIN-1, un omologo GW182; e 2) ALG-1 e HRPK-1, un interagente ALG-1 appena identificato2. ALG-1 e AIN-1 sono proteine fondamentali che comprendono il complesso silenziatore indotto da microRNA (miRISC) e l’interazione tra queste due proteine èben consolidata 10,11. Il protocollo di preparazione dell’estratto è stato efficace nell’esperimento di co-immunoprecipitazione ALG-1-AIN-1. Questo protocollo ha anche confermato con successo l’interazione tra ALG-1 e il suo interagentore appena identificato, HRPK-12.
In sintesi, il manoscritto descrive un protocollo di preparazione dell’estrazione di C. elegans che può essere scalato fino a elaborare simultaneamente 24 campioni insieme a un protocollo di co-immunoprecipitazione che può essere utilizzato per identificare nuove o confermare interazioni ipotizzate tra proteine. Il protocollo di preparazione dell’estratto è compatibile con una serie di esperimenti a valle, tra cui l’immunoprecipitazioneproteica 2 e i pulldown di microRNA12. Inoltre, il protocollo di immunoprecipitazione può essere adattato per testare le interazioni tra due o più proteine endogene, taggate endogenamente o C. elegans sovraespresse in una varietà di background genetici.
C. elegans è un ottimo modello per lo studio delle questioni fondamentali in biologia cellulare, molecolare e dello sviluppo19. Oltre al suo potere come sistema di modelli genetici, C. elegans è suscettibile di approcci biochimici, tra cui, a titolo considerato, immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione proteica. Un potenziale ostacolo quando si conducono esperimenti di immunoprecipitazione è la mancanza di anticorpi specifici per le proteine di interesse. Se non è disponibile alcun anticorpo, è possibile generare anticorpi policlonali o monoclonali personalizzati. Tuttavia, le recenti innovazioni nella tecnologia di editing del genoma hanno permesso ai ricercatori di introdurre rapidamente mutazioni o taggare geni endogeni C. elegans 20,21, facilitando studi che svelano le interazioni genetiche, funzionali e fisiche tra i geni e le proteine codificate. In particolare, l’etichettatura mediata da CRISPR/Cas9 dei geni C. elegans nei loci endogeni ha ridotto la dipendenza degli esperimenti di immunoprecipitazione dalla disponibilità di anticorpi, rendendo gli esperimenti di co-immunoprecipitazione molto più fattibili. I geni C. elegans possono essere taggati con una varietà di tag che vanno da tag fluorescenti come GFP o mCherry a piccoli tag come FLAG e HA. Gli anticorpi che riconoscono questi tag sono prontamente disponibili commercialmente, facilitando gli studi sulle interazioni proteina-proteina attraverso approcci di immunoprecipitazione.
Il protocollo presentato, descritto nella figura 1, può essere eseguito per un numero limitato di campioni o scalato, consentendo fino a 24 preparati campione alla volta. Mentre le caratterizzazioni iniziali delle interazioni proteina-proteina attraverso l’immunoprecipitazione sono tipicamente fatte in background di tipo selvatico in normali condizioni di crescita, gli studi di follow-up richiedono spesso di testare le interazioni proteina-proteina in una varietà di background genetici o in diverse condizioni di crescita. La capacità di preparare contemporaneamente più estrazioni consente di risparmiare tempo e, cosa importante, garantisce la coerenza della preparazione dell’estrazione tra i diversi campioni. È sempre necessario un controllo negativo, con il controllo ideale che è una mutazione nulla nella codifica genica per la proteina di interesse immunoprecipitata (vedi figura 3 e figura 4 per esempi).
Questo protocollo di estrazione consente una rapida preparazione dell’estratto proteico da campioni di C. elegans ed è paragonabile all’omogeneizzazione a base di perline di zirconio8. L’omogeneizzazione delle perline in generale può essere scalata fino a più preparati simultanei di campioni utilizzando una varietà di omogeneizzatori di mulini perline o apparecchiature simili. Tuttavia, alcuni omogeneizzatori più economici per mulini perline possono ridurre il numero di campioni che possono essere lavorati contemporaneamente. In alternativa, il protocollo di estrazione presentato è compatibile con la preparazione dell’estratto a base di dounce, che rappresenta un’alternativa economica. Mentre diversi omogeneizzatori di mulini di perline non sono stati testati, la maggior parte è probabile che sia compatibile con questo protocollo di estrazione proteica, purché si ottiene una completa interruzione dei campioni di C. elegans.
Come presentato, questo protocollo di preparazione dell’estratto è compatibile con più esperimenti a valle, tra cui l’immunoprecipitazioneproteica 2 e il pull-down di microRNA12 e consente la raccolta a valle di componenti di proteine e RNA. Estrae inoltre in modo efficiente proteine nucleari e citoplasmatiche (Figura 2, Figura 3e Figura 4). Allo stesso modo, il protocollo di immunoprecipitazione presentato consente l’isolamento dell’RNA dagli immunopreciti associati alle proteine. Mentre il protocollo di immunoprecipitazione è stato originariamente sviluppato per identificare gli interattori proteici ALG-1, il metodo può essere adattato per testare le interazioni tra qualsiasi proteina di interesse. Infatti, le condizioni di immunoprecipitazione utilizzate hanno funzionato altrettanto bene per l’immunoprecipitazione di ALG-1 (Figura 3) e HRPK-1(Figura 4). Questo protocollo è un ottimo punto di partenza per l’immunopurificazione delle proteine leganti l’RNA. Va notato, tuttavia, che alcuni cambiamenti nella composizione tampone possono essere necessari per altre proteine di interesse. I cambiamenti possono dipendere dalle proprietà fisiche e biochimiche della proteina di interesse e devono essere attuati caso per caso.
Una volta che la proteina bersaglio (qui, ALG-1 o HRPK-1) è immunoprecipitata, l’blotting occidentale può essere utilizzato per testare il co-immunoprecipitato per specifici interattori proteici.
In alternativa, l’immunoprecipitato copurato può essere sottoposto ad analisi di spettrometria di massa per identificare tutte le proteine putative interagenti. Le interazioni co-immunoprecipitazione confermate possono quindi essere esaminate in una varietà di background genetici o condizioni per identificare la potenziale regolazione dell’interazione specifica. Ad esempio, per determinare se hrpk-1 svolge un ruolo nell’assemblaggio miRISC ALG-1/AIN-1, la coprecipitazione ALG-1-AIN-1 è stata valutata sia in uno sfondo di tipo selvaggio che in assenza di HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 è stato trovato dispensabile per l’interazione ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Inoltre, la tecnologia di editing del genoma CRISPR/Cas9 può essere utilizzata per generare mutazioni del singolo punto o del dominio nelle proteine di interesse. Ritestare la capacità dei mutanti generati di coprecipitate con i loro interattori proteici può rivelare quali domini o residui mediano l’interazione fisica. Tali studi futuri possono fornire informazioni preziose sul meccanismo della funzione e della regolazione delle proteine. Questi approcci, combinati con il potere della genetica C. elegans, possono fornire importanti intuizioni sui processi molecolari fondamentali che governano lo sviluppo animale e la funzione cellulare.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato in parte supportato da Kansas INBRE, P20GM103418 a Li e Zinovyeva e R35GM124828 a Zinovyeva. Ringraziamo Min Han per aver generosamente condiviso l’anticorpo anti-AIN-1. Alcuni dei ceppi utilizzati nel corso di questo lavoro sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finanziato dall’Ufficio dei programmi di infrastruttura di ricerca del NIH (P40 OD010440).
15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
N2 wild type | CGC | ||
Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |