Eiwitextractpreparaat en co-immunoprecipitatie van Caenorhabditis elegans
Summary
Deze methode beschrijft een protocol voor eiwitextractpreparaat met hoge doorvoer uit Caenorhabditis elegans-monsters en daaropvolgende co-immunoprecipitatie.
Abstract
Co-immunoprecipitatiemethoden worden vaak gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen. Bevestiging van veronderstelde eiwit-eiwit interacties of identificatie van nieuwe kan onschatbare informatie over de functie van een eiwit van belang. Sommige van de traditionele methoden voor extractvoorbereiding vereisen vaak arbeidsintensieve en tijdrovende technieken. Hier wordt een aangepast extractvoorbereidingsprotocol met behulp van een kraalmolenhomogenisator en metalen kralen beschreven als een snel alternatief voor traditionele eiwitbereidingsmethoden. Deze extractpreparaatmethode is compatibel met downstream co-immunoprecipitatiestudies. Als voorbeeld werd de methode gebruikt om C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 en twee bekende ALG-1 interactors met succes te co-immunoprecipitaat: AIN-1 en HRPK-1. Dit protocol bevat beschrijvingen van het verzamelen van dierlijke monsters, het bereiden van extracten, het verduidelijken van extracten en eiwitimmunoprecipitatie. Het beschreven protocol kan worden aangepast om te testen op interacties tussen twee of meer endogene, endogene gelabelde of overexpressie C. elegans-eiwitten in verschillende genetische achtergronden.
Introduction
Het identificeren van de macromoleculaire interacties van een interessant eiwit kan de sleutel zijn om meer te weten te komen over de functie ervan. Immunoprecipitatie- en co-immunoprecipitatie-experimenten kunnen worden gebruikt om het volledige interactoom van een eiwit te identificeren via grootschalige proteomische benaderingen1 of om specifiek het vermogen van een eiwit om te coprecipitaten met een veronderstelde interactor te testen. Bij C. eleganszijn beide methoden met succes gebruikt om meer te weten te komen over de activiteit van een verscheidenheid aan eiwitten , waaronder die welke nauw samenwerken met microRNAs om genexpressie2,3,4te reguleren . Co-immunoprecipitatie-experimenten hebben het voordeel dat ze de eiwit-eiwitinteracties in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving testen, maar extractvoorbereiding kan uitdagend en tijdrovend zijn. Efficiënte lysis van het monster is noodzakelijk, maar er moet voor worden gezorgd dat de verstoring van eiwit-eiwitinteracties tot een minimum wordt beperkt. Methoden zoals douncing5,sonicatie6,Balch homogenisatie7,en zirkonia kralen-homogenisatie8,9 zijn gebruikt om met succes te bereiden C. elegans totale eiwitextracten. Deze methoden, met uitzondering van zirkonia kraal homogenisatie, hebben beperkingen in termen van het aantal monsters dat tegelijkertijd kan worden verwerkt. Gepresenteerd is een alternatieve methode die gemakkelijk kan worden opgeschaald om een snelle eiwitextractvoorbereiding met hoge doorvoer mogelijk te maken uit C. elegans-monsters, gevolgd door co-immunoprecipitatie. In het bijzonder kan de methode tot 24 monsters tegelijk bereiden, waardoor de tijd die nodig is voor het bereiden van extracten aanzienlijk wordt verkort. Douncing daarentegen maakt meestal slechts één monstervoorbereiding tegelijk mogelijk. Deze extractmethode kan worden gebruikt om extracten te bereiden uit elke ontwikkelingsfase van C. elegans.
Beschreven is een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van dierlijke monsters, extractvoorbereiding, immunoprecipitatie en presentatie van westerse blaasgegevens om succesvolle eiwituittrekkracht en detectie van het co-immunoprecipiterende eiwit van belang te bevestigen. Om de effectiviteit van het protocol aan te tonen, werden twee co-immunoprecipitatie-experimenten uitgevoerd tussen 1) microRNA Argonaute ALG-1 en AIN-1, een GW182 homolog; en 2) ALG-1 en HRPK-1, een nieuw geïdentificeerde ALG-1 interactor2. ALG-1 en AIN-1 zijn kerneiwitten die het microRNA-geïnduceerde geluiddempingscomplex (miRISC) omvatten en de interactie tussen deze twee eiwitten is goed ingeburgerd10,11. Het extractpreparaatprotocol was effectief in het ALG-1-AIN-1 co-immunoprecipitatie-experiment. Dit protocol bevestigde ook met succes de interactie tussen ALG-1 en zijn nieuw geïdentificeerde interactor, HRPK-12.
Samengevat beschrijft het manuscript een C. elegans extractpreparaatprotocol dat kan worden opgeschaald om tegelijkertijd 24 monsters te verwerken, samen met een co-immunoprecipitatieprotocol dat kan worden gebruikt om nieuwe of veronderstelde interacties tussen eiwitten te identificeren of te bevestigen. Het extractpreparaatprotocol is compatibel met een aantal downstream-experimenten, waaronder eiwitimmunoprecipitatie2 en microRNA pulldowns12. Bovendien kan het immunoprecipitatieprotocol worden aangepast om te testen op interacties tussen twee of meer endogene, endogene gelabelde of overexpressie C. elegans-eiwitten in verschillende genetische achtergronden.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans is een uitstekend model voor het bestuderen van fundamentele vragen in cel-, moleculaire en ontwikkelingsbiologie19. Naast zijn kracht als genetisch modelsysteem, is C. elegans vatbaar voor biochemische benaderingen, waaronder, maar niet beperkt tot, eiwit immunoprecipitatie en co-immunoprecipitatie. Een mogelijke hindernis bij het uitvoeren van immunoprecipitatie-experimenten is het ontbreken van antilichamen die specifiek zijn voor de eiwitten van belang. Als er geen antilichamen beschikbaar zijn, kunnen aangepaste polyklonale of monoklonale antilichamen worden gegenereerd. Recente innovaties in genoombewerkingstechnologie hebben onderzoekers echter in staat gesteld om snel mutaties te introduceren of endogene C. elegans-genen 20,21tetaggen , waardoor studies mogelijk zijn die de genetische, functionele en fysieke interacties tussen de genen en de gecodeerde eiwitten ontrafelen. Met name crispr/cas9-gemedieerde tagging van C. elegans genen op de endogene loci heeft de afhankelijkheid van immunoprecipitatie experimenten op de beschikbaarheid van antilichamen verminderd, waardoor co-immunoprecipitatie experimenten veel haalbaarder zijn geworden. C. elegans genen kunnen worden getagd met een verscheidenheid aan tags, variërend van fluorescerende tags zoals GFP of mCherry tot kleine tags zoals FLAG en HA. Antilichamen die deze tags herkennen, zijn direct commercieel beschikbaar, waardoor de studies naar eiwit-eiwitinteracties via immunoprecipitatiebenaderingen worden vergemakkelijkt.
Het gepresenteerde protocol, beschreven in figuur 1,kan worden uitgevoerd voor een klein aantal monsters of worden opgeschaald, waardoor maximaal 24 monsterpreparaten tegelijk mogelijk zijn. Hoewel de eerste karakteriseringen van eiwit-eiwitinteracties via immunoprecipitatie meestal worden gedaan in wilde typeachtergronden onder normale groeiomstandigheden, vereisen vervolgstudies vaak het testen van de eiwit-eiwitinteracties in verschillende genetische achtergronden of onder verschillende groeiomstandigheden. De mogelijkheid om tegelijkertijd meerdere extracten te bereiden bespaart tijd en, belangrijker nog, zorgt voor consistentie van de extractvoorbereiding tussen de verschillende monsters. Een negatieve controle is altijd vereist, waarbij de ideale controle een nulmutatie is in de gencodering voor het immunoprecipiteerde eiwit van belang (zie figuur 3 en figuur 4 voor voorbeelden).
Dit extractprotocol maakt een snelle bereiding van eiwitextracten uit C. elegans-monsters mogelijk en is vergelijkbaar met homogenisatie op basis van zirkoniumkraal8. Kraalhomogenisatie in het algemeen kan worden opgeschaald naar meerdere gelijktijdige monsterpreparaten met behulp van een verscheidenheid aan kraalmolenhomogenisatoren of soortgelijke apparatuur. Sommige zuinigere kraalmolenhomogenisatoren kunnen echter het aantal monsters verminderen dat tegelijkertijd kan worden verwerkt. Als alternatief is het gepresenteerde extractprotocol compatibel met extractpreparaat op basis van dounce, wat een economisch alternatief is. Hoewel verschillende kraalmolenhomogenisatoren niet werden getest, zijn de meeste waarschijnlijk compatibel met dit eiwitextractprotocol, zolang volledige verstoring van de C. elegans-monsters wordt bereikt.
Zoals gepresenteerd, dit extract voorbereiding protocol is compatibel met meerdere downstream experimenten, met inbegrip van eiwit immunoprecipitatie2 en microRNA pull-down12 en maakt het mogelijk voor downstream verzameling van zowel eiwit en RNA componenten. Het extraheert ook efficiënt zowel nucleaire als cytoplasmatische eiwitten (figuur 2, figuur 3en figuur 4). Evenzo maakt het gepresenteerde immunoprecipitatieprotocol RNA-isolatie van eiwitgerelateerde immunoprecipitaten mogelijk. Terwijl het immunoprecipitatieprotocol oorspronkelijk werd ontwikkeld om ALG-1 eiwitinteracties te identificeren, kan de methode worden aangepast om te testen op interacties tussen alle eiwitten van belang. In feite werkten de gebruikte immunoprecipitatieomstandigheden even goed voor immunoprecipiterende ALG-1 (figuur 3) en HRPK-1 (figuur 4). Dit protocol is een uitstekend uitgangspunt voor immunopurificatie van RNA-bindende eiwitten. Er zij echter op gewezen dat sommige veranderingen in de buffersamenstelling nodig kunnen zijn voor andere eiwitten van belang. De veranderingen kunnen afhangen van de fysische en biochemische eigenschappen van het eiwit van belang en moeten van geval tot geval worden geïmplementeerd.
Zodra het doeleiwit (hier, ALG-1 of HRPK-1) immunoprecipitated is, kan western blotting worden gebruikt om het co-immunoprecipitaat te testen op specifieke eiwit interactoren.
Als alternatief kan het gecopureerde immunoprecipitaat worden onderworpen aan massaspectrometrieanalyse om alle putatieve interacterende eiwitten te identificeren. Bevestigde co-immunoprecipitatie interacties kunnen vervolgens worden onderzocht in een verscheidenheid van genetische achtergronden of voorwaarden om potentiële regulering van de specifieke interactie te identificeren. Om bijvoorbeeld te bepalen of hrpk-1 een rol speelt in alg-1/AIN-1 miRISC assemblage, werd ALG-1-AIN-1 coprecipitatie beoordeeld zowel op een wilde type achtergrond als bij afwezigheid van HRPK-1 (Figuur 3). hrpk-1 bleek overbodig te zijn voor ALG-1/AIN-1 interactie2 (figuur 3). Bovendien kan CRISPR/Cas9 genoombewerkingstechnologie worden gebruikt om mutaties met één punt of domeinverwijdering in de eiwitten van belang te genereren. Het opnieuw testen van het vermogen van de gegenereerde mutanten om te coprecipitaten met hun eiwitinteracties kan onthullen welke domeinen of residuen de fysieke interactie bemiddelen. Dergelijke toekomstige studies kunnen onschatbare informatie opleveren over het mechanisme van eiwitfunctie en -regulering. Deze benaderingen, gecombineerd met de kracht van C. elegans genetica, kunnen belangrijke inzichten bieden in de fundamentele moleculaire processen die de ontwikkeling van dieren en cellulaire functie bepalen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Kansas INBRE, P20GM103418 aan Li en Zinovyeva en R35GM124828 aan Zinovyeva. We danken Min Han voor het royaal delen van het anti-AIN-1 antilichaam. Sommige van de stammen die in de loop van dit werk werden gebruikt, werden geleverd door het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
References
- Liu, X., et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).
- Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development. PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).
- Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).
- Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans. Cell. 136 (5), 926-938 (2009).
- Zou, Y., et al. Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers. Science. 340 (6130), 372-376 (2013).
- Zanin, E., Dumont, J., et al. Affinity purification of protein complexes in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).
- Kohl, K., et al. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).
- Larance, M., Bailly, A. P., et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).
- Ding, L., Han, M. GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing. Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).
- Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans. Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).
- Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices. Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression. PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).
- Zhang, L., et al. Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2. Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Farboud, B., et al. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
