Изоляция ядра жировой ткани для одноклеточных геномных приложений
Summary
В этой публикации описывается протокол изоляции ядер от зрелых адипоцитов, очищение путем флуоресценции активированной сортировки и транскриптомики одноклеточного уровня.
Abstract
Коричневый и бежевый жир являются специализированными жировыми тканями, которые рассеивают энергию для термогенеза UCP1 (Uncoupling Protein-1) -зависимых и независимых путей. До недавнего времени термогенные адипоциты считались однородной популяцией. Тем не менее, недавние исследования показали, что Существует несколько подтипов или субпопуляций, которые отличаются по происхождению развития, использованию субстрата и транскриптом. Несмотря на достижения в одноклеточной геномике, беспристрастное разложение жировых тканей в клеточные подтипы было сложным из-за хрупкого характера заполненных липидами адипоцитов. Представленный протокол был разработан для обхода этих препятствий путем эффективной изоляции одиночных ядер от жировой ткани для применения ниже по течению, включая секвенирование РНК. Сотовая неоднородность может быть проанализирована с помощью секвенирования РНК и биоинформатического анализа.
Introduction
Исследования показали, что коричневая жировая ткань (BAT) обладает замечательной способностью рассеивать энергию. Два типа термогенных адипоцитов с различными особенностями развития существуют как у грызунов, так и у человека: бежевые адипоциты и классические коричневые адипоциты. В то время как классические коричневые адипоциты расположены в основном в межкапялярных депо BAT, бежевые адипоциты спорадически возникают в белой жировой ткани (WAT) в ответ на определенные физиологические сигналы, такие как хроническое воздействие холода, процесс, именуемый “коричневый” или “beiging”. Благодаря использованию передовых изображений, теперь ясно, что взрослые люди имеют существенные склады UCP1и BAT, особенно в супраклавикулярной области1,2,3,4. Количество взрослого человека BAT обратно коррелирует с ожирением и может быть увеличена внешними сигналами, такими как хроническое воздействие холода5,,6 или 3-адренергических рецепторов агонист7. Затраты энергии при посредничестве BAT могут предложить жизнеспособный подход к борьбе с ожирением.
До недавнего времени термогенные адипоциты считались однородной популяцией. Тем не менее, исследования показали существование нескольких подтипов или субпопуляций, которые отличаются по развитию происхождения, использования субстрата, и транскриптом8,,9,10. Например, тип бежевого адипоцита, который преимущественно использует глюкозу для термогенеза, g-бежевого адипоцита, был недавно описан10. Неполное понимание типов клеток в коричневой и бежевой жировой ткани и отсутствие конкретных маркеров представляют собой критический барьер для изучения их биологических функций.
Традиционные методы изоляции субпопуляций клеток основаны на экспрессии лишь нескольких известных генов маркеров. Последние достижения в области одноклеточной геномики позволяют использовать глобальные данные экспрессии генов отдельных клеток для объективной оценки количества субпопуляций в ткани. Конечная цель этого протокола заключается в определении всех подтипов жировой ткани под различными термогенными стимулами при одноклеточном разрешении. В отличие от других тканей и типов клеток, определение клеточных подтипов жировой ткани является сложной задачей из-за хрупкости заполненных липидами адипоцитов. В настоящем документе вводится надежный протокол для изоляции одиночных ядер от жировой ткани для применения ниже по течению до секвенирования snRNA. Важно отметить, что недавняя литература сравнения хорошо подобранных однонуклейных РНК секвенирования (snRNA-seq) и одноклеточного секвенирования РНК (scRNA-seq) наборы данных показали, что snRNA-seq сравним с scRNA-seq в обнаружении типа клеток, и превосходит в клеточном покрытии для сложной ткани, как мозг11. Этот протокол сочетает в себе метод центрифугации градиента плотности, оптимизированный для жировых тканей Rosen et al.12 с ядерным шагом «очистки» с высокоскоростным сортировщиком MoFlo XDP. Как видно из репрезентативных результатов, анализ 7500 одиночных ядер из мыши межкаплуановой коричневой жировой ткани определили несколько типов клеток в, казалось бы, однородных коричневых адипоцитов. В целом, этот простой и надежный протокол может быть применен для изучения тканевой организации адипоцитов и жировых клеток-резидентов, идентификации подтип-специфических генов маркеров и фенотипирования жирово-селективных нокаутов/трансгенных мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представлен простой и надежный метод изоляции одиночных ядер и изучения неоднородности жировой ткани. По сравнению с секвенированием РНК всей ткани, этот рабочий процесс предлагает объективное представление о клеточной неоднородности и маркерах, специфичных для популяций. Это являе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Рейнольдса из ядра геномики Альберта Эйнштейна и Цзинханга Чжана из ядра потока Cytometry за техническую поддержку. Мы признаем поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH) (DK110426) и экспериментальных и технико-экономических грантов от Эйнштейна-Гора Синай Диабет исследовательский центр (DK020541), и Нью-йоркский центр исследований ожирения (DK026687) (все к К.С.). Мы также хотели бы поблагодарить Онкологический центр Альберта Эйнштейна (CA013330) за поддержку.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
