Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen

Studien haben gezeigt, dass braunes Fettgewebe (BAT) eine bemerkenswerte Fähigkeit hat, Energie abzuleiten. Zwei Arten von thermogenen Adipozyten mit unterschiedlichen Entwicklungsmerkmalen existieren sowohl bei Nagetieren als auch beim Menschen: Beige-Adipozyten und klassische braune Adipozyten. Während sich klassische braune Adipozyten meist in interscapularen BVT-Depots befinden, entstehen beige adipozyten sporadisch in weißem Fettgewebe (WAT) als Reaktion auf bestimmte physiologische Hinweise, wie chronische Kälteexposition, ein Prozess, der als “Browning” oder “Beiging” bezeichnet wird. Durch den Einsatz von fortgeschrittener Bildgebung ist nun klar, dass erwachsene Menschen über erhebliche Depots von UCP1⁺ BAT verfügen, insbesondere in der supktoicularen Region^1,2,3,4. Die Menge der erwachsenen menschlichen BAT korreliert umgekehrt mit Fettleibigkeit und kann durch externe Hinweise erhöht werden, wie chronische Kälteexposition^5,6 oder 3-adrenergen Rezeptoragonist^en7. DIE von BVT vermittelten Energieausgaben können einen praktikablen Ansatz zur Bekämpfung von Fettleibigkeit bieten.

Bis vor kurzem galten thermogene Adipozyten als homogene Population. Studien haben jedoch die Existenz mehrerer Subtypen oder Subpopulationen aufgedeckt, die sich in Entwicklungsherkunft, Substratnutzung und Transkriptom^8,,9,10unterscheiden. Zum Beispiel wurde kürzlich eine Art von Beige-Adipozyten beschrieben, die bevorzugt Glukose für die Thermogenese verwendet, die g-beige adipocyte, vor kurzem¹⁰beschrieben. Das unvollständige Verständnis von Zelltypen in braunem und beigeem Fettgewebe und das Fehlen spezifischer Marker stellen ein kritisches Hindernis für die Untersuchung ihrer biologischen Funktionen dar.

Herkömmliche Methoden zur Isolierung von Subpopulationen von Zellen basieren auf der Expression nur einiger bekannter Markergene. Jüngste Fortschritte in der einzelzelligen Genomik ermöglichen die Verwendung globaler Genexpressionsdaten einzelner Zellen, um eine unvoreingenommene Schätzung der Anzahl der Subpopulationen in einem Gewebe zu liefern. Das Endziel dieses Protokolls ist es, alle Fettgewebe-Subtypen unter verschiedenen thermogenen Reizen in einer einzelzelligen Auflösung zu bestimmen. Im Gegensatz zu anderen Geweben und Zelltypen ist die Bestimmung zellulärer Subtypen von Fettgewebe aufgrund der Fragilität von lipidgefüllten Adipozyten eine Herausforderung. Dieses Papier führt ein robustes Protokoll ein, um einzelne Kerne aus Fettgewebe für die nachgeschaltete Anwendung zur SnRNA-Sequenzierung zu isolieren. Wichtig ist, dass aktuelle Literatur, die gut aufeinander abgestimmte Single-Nuklei-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und einzellige RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) vergleicht, zeigte, dass snRNA-seq mit scRNA-seq in der Zelltyp-Detektion vergleichbar ist und in der zellulären Abdeckung für ein komplexes Gewebe wie das Gehirn^{überlegen ist 11}. Dieses Protokoll kombiniert eine Dichtegradientenzentrifugationsmethode, die von Rosen et al.¹² für Fettgewebe optimiert wurde, mit einem “Cleanup”-Schritt der Kerne mit einem MoFlo XDP High Speed Sorter. Wie in den repräsentativen Ergebnissen zu sehen ist, identifizierte eine Analyse von 7.500 einzelnen Kernen aus dem interskapulären braunen Fettgewebe der Maus mehrere Zelltypen in scheinbar homogenen braunen Adipozyten. Insgesamt kann dieses einfache und robuste Protokoll angewendet werden, um die Organisation von Adipozyten und adipose-residenten Zellen auf Gewebeebene, die Identifizierung subtypspezifischer Markergene und die Entwicklung von Phänotypisierung von adipose-selektiven Knockout/transgenen Mäusen zu untersuchen.