عزل النوى الأنسجة الدهنية لتطبيقات الجينوم وحيد الخلية
Summary
يصف هذا المنشور بروتوكولًا لعزل النوى عن الخلايا الشحمية الناضجة ، والتنقية عن طريق الفرز المُفعّل بالفلور ، و نسخ مستوى الخلية الواحدة.
Abstract
الدهون البنية والبيج هي الأنسجة الدهنية المتخصصة التي تبدد الطاقة لحرارة الثيرموغين من قبل UCP1 (فك البروتين-1)-تعتمد على مسارات مستقلة. حتى وقت قريب، كانت تعتبر الخلايا الدهنية الحرارية سكانية متجانسة. ومع ذلك، أشارت الدراسات الحديثة إلى أن هناك أنواع فرعية أو شعَبَة فرعية متعددة تتميز في الأصل التنموي، واستخدام الركيزة، والنصوص. على الرغم من التقدم في الجينوم وحيد الخلية، كان التحلل غير المتحيز للأنسجة الدهنية في الأنواع الفرعية الخلوية تحديا بسبب الطبيعة الهشة للدهون المليئة بالدهون. وقد تم تطوير البروتوكول المقدم للتحايل على هذه العقبات من خلال العزل الفعال للنيات وحيدة من الأنسجة الدهنية لتطبيقات المصب، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي. ويمكن بعد ذلك تحليل التغاير الخلوي عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليلات المعلوماتية الحيوية.
Introduction
وقد أظهرت الدراسات أن الأنسجة الدهنية البني (BAT) لديه قدرة ملحوظة لتبديد الطاقة. نوعان من الخلايا الدهنية الحرارية ذات سمات تنموية مميزة موجودة في كل من القوارض والبشر: adipocytes البيج والكلاسيكية البنية الكلاسيكية. بينما توجد الخلايا الدهنية البنية الكلاسيكية في الغالب في مستودعات BAT بين الأغطية، تظهر الخلايا الشحمية البيج بشكل متقطع في الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) استجابة لبعض الإشارات الفسيولوجية، مثل التعرض للبرد المزمن، وهي عملية يشار إليها باسم “براونينغ” أو “beiging”. من خلال استخدام التصوير المتقدم ، أصبح من الواضح الآن أن البشر البالغين لديهم مستودعات كبيرة من UCP1+ BAT ، خاصة في المنطقة فوق الاعلى من الاعلى من الاعلى ،,2،3،14. كمية الإنسان الكبار BAT يرتبط عكسيا مع adiposity ويمكن زيادتها عن طريق العظة الخارجية، مثل التعرض للبرد المزمن5،6 أو β3-adrenergic مستقبلاتناهض 7. وقد يوفر الإنفاق على الطاقة بوساطة BAT نهجاً قابلاً للتطبيق لمكافحة السمنة.
حتى وقت قريب، كانت تعتبر الخلايا الدهنية الحرارية سكانية متجانسة. ومع ذلك، فقد كشفت الدراسات عن وجود أنواع فرعية متعددة أو سكانية فرعية متميزة في الأصل التنموي، واستخدام الركيزة، ونسخ8و99و10., على سبيل المثال، تم وصف نوع من adipocyte البيج التي تستخدم بشكل تفضيلي الجلوكوز لthersgenesis، وg-البيج adipocyte، مؤخرا10. يشكل الفهم غير الكامل لأنواع الخلايا في الأنسجة الدهنية البنية والبيج وعدم وجود علامات محددة عائقًا حاسمًا أمام دراسة وظائفها البيولوجية.
وتستند الطرق التقليدية لعزل الاكتظاظ الفرعي للخلايا على التعبير عن جينات قليلة معروفة فقط. إن التطورات الحديثة في الجينومات أحادية الخلية تمكن من استخدام بيانات التعبير الجيني العالمي للخلايا المفردة لتوفير تقدير غير متحيز لعدد السكان الفرعيين في الأنسجة. الهدف النهائي لهذا البروتوكول هو تحديد جميع الأنواع الفرعية الأنسجة الدهنية تحت مختلف المحفزات الحرارية في قرار خلية واحدة. على النقيض من الأنسجة الأخرى وأنواع الخلايا، وتحديد الأنواع الفرعية الخلوية من الأنسجة الدهنية هو التحدي بسبب هشاشة الشحمية الدهنية. هذه الورقة يقدم بروتوكول قوي لعزل النوى واحدة من الأنسجة الدهنية لتطبيق المصب لتسلسل snRNA. الأهم من ذلك ، الأدب الحديث مقارنة مطابقة جيدا تسلسل الحمض النووي الريبي واحد (snRNA – seq) و CELLN -cell تسلسل (SCRNA – seq) كشفت مجموعات البيانات أن snRNA – seq هو مماثل لsرنا – ما بعد في الكشف عن نوع الخلية ، ومتفوقة في التغطية الخلوية لنسيج معقد مثل الدماغ11. يجمع هذا البروتوكول بين أسلوب الطارد المركزي للتدرج الكثافة الأمثل للأنسجة الدهنية بواسطة Rosen etal. 12 مع خطوة “تنظيف” نوية مع فارز السرعة العالية MoFlo XDP. كما رأينا في النتائج التمثيلية، حدد تحليل 7500 نوى واحد من الأنسجة الدهنية البنية بين الماوس بين الكتفين أنواع خلايا متعددة داخل الخلايا الدهنية البني المتجانسة على ما يبدو. وعموما، يمكن تطبيق هذا البروتوكول البسيط والقوية لدراسة تنظيم الأنسجة على مستوى الخلايا الشحمية والخلايا الدهنية المقيمة، وتحديد جينات علامة النوع الفرعي، وتطوير ظاهري من الفئران خروج المغلوب /المعدلة وراثيا الدهنية انتقائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تقديم طريقة واضحة وقوية لعزل النوى واحدة ودراسة عدم تجانس الأنسجة الدهنية. بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي الأنسجة بأكملها، يوفر هذا العمل وجهة نظر غير متحيزة من عدم تجانس الخلوية وعلامات السكان محددة. هذا أمر مهم ومبتكر من أجل النهوض بالأحياء الشحمية، والتمثيل الغذائي الجزيئ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ديفيد رينولدز من جوهر ألبرت آينشتاين للجينوم وJinghang تشانغ من تدفق Cytometry الأساسية للدعم التقني. نحن نعترف بالدعم من المعاهد القومية للصحة (DK110426) ومنح تجريبية وجدوى من مركز آينشتاين ماونت سيناي لأبحاث السكري (DK020541)، ومركز نيويورك لبحوث السمنة (DK026687) (جميع إلى K.S.). ونود أيضا أن نشكر مركز ألبرت آينشتاين للسرطان (CA013330) على الدعم الأساسي.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
