Оценка глобальной глазной структуры после космических полетов с использованием метода микро-компьютерной томографии (Micro-CT)
Summary
Мы представляем протокол с использованием микро-компьютерной томографии высокого разрешения, чтобы определить, является ли космический полет индуцированных повреждений глазных структур. Протокол показывает микро-CT-производные измерения ex vivo грызунов глазных структур. Мы демонстрируем способность оценивать глазные морфологические изменения после космических полетов с помощью неразрушающей трехмерной техники для оценки глазного повреждения.
Abstract
Отчеты показывают, что длительное воздействие космической среды приводит к морфологическим и функциональным офтальмологическим изменениям у астронавтов во время и после миссии Международной космической станции (МКС). Однако основные механизмы этих космических полетов, вызванных изменениями, в настоящее время неизвестны. Целью настоящего исследования было определение влияния космической среды на глазные структуры путем оценки толщины сетчатки мыши, эпителия пигмента сетчатки (RPE), хороидного и склерового слоя с использованием микро-КТ-изображения. Десятинедельные мыши C57BL/6 были размещены на борту ISS для 35-дневной миссии, а затем вернулись на Землю живыми для анализа тканей. Для сравнения, наземные мыши контроля (ГК) на Земле поддерживались в одинаковых условиях окружающей среды и оборудования. Образцы глазной ткани были собраны для анализа микро-КТ в течение 38 (±4) часов после брызг. Изображения поперечного сечения сетчатки, RPE, хороида и слоя склеры фиксированного глаза были записаны в осяном и сагиттном виде с помощью метода микро-КТ изображения. Анализ микро-КТ показал, что поперечные области толщины слоя сетчатки, RPE и хороидного слоя были изменены в образцах космических полетов по сравнению с GC, при этом образцы космических полетов показали значительно более тонкие поперечные сечения и слои по сравнению с управлением. Результаты этого исследования показывают, что микро-КТ оценка является чувствительным и надежным методом для характеристики глазных изменений структуры. Ожидается, что эти результаты улучшат понимание воздействия экологической нагрузки на глобальные глазные структуры.
Introduction
В условиях микрогравитации космических полетов повышенное внутричерепное давление (МСП), вызванное смещением жидкости, возможно, способствовало возникновению связанного с космическим полетом нервно-глазного синдрома (SANS)1,,2,,3,,4,,5. Действительно, более 40% астронавтов испытали SANS во время и после Миссии Международной космическойстанции (МКС) 6, в том числе космического полета предмет НАСА БлизнецыИсследование 7. Текущая патофизиология SANS включает в себя физиологические изменения, такие как отек зрительного диска, уплощение земного шара, хороидные и сетчатки складки, гиперопические рефракционные сдвиги ошибок, и нервные волокна слоя инфарктов (т.е. пятна ваты)и хорошо документированы 5,8. Однако основные механизмы изменений и факторов, способствующих развитию ущерба, неясны. Для того, чтобы лучше понять SANS, животные модели доступны для характеристики космических полетов связанных изменений в структуре и функции сетчатки.
В предыдущем исследовании на тех же животных, мы сообщили о влиянии 35 дней космических полетов на сетчатке мыши. Результаты показывают, что космические полеты вызывает значительные повреждения в сетчатке и сетчатке сосудов, и некоторые белки / пути, связанные со смертью клеток, воспаление и метаболический стресс были значительно изменены после космического полета9.
В настоящее время существует целый ряд неинвазивных методов визуализации, созданных для мониторинга развития и прогрессирования заболеваний, а также физиологических реакций на различные экологические стрессоры, которые также широко используются в моделях мелких грызунов. Одним из таких методов является микро-КТ, который оценивает анатомические структуры и патологические процессы, и успешно используется на организмы, как малые, какмыши 10.
Микро-КТ может достичь микросхемного разрешения, и это может обеспечить высокий контраст для объемного анализа мягких тканей сдобавлением соответствующего контрастного агента 10,,11,,12,,13,,14. Технология micro-CT выгодна по сравнению с традиционными методами, такими как валовая анатомия, световая микроскопия и гистологическое исследование, так как она сводит к минимуму физический ущерб геометрическому профилю образцов и не изменяет пространственные отношения между структурами. Кроме того, трехмерные (3D) модели структур могут быть реконструированы на основе микроКТ-изображений12,,14. На сегодняшний день, несмотря на данные, показывающие ухудшение зрения после воздействия космической среды, имеется мало данных в моделях животных для лучшего понимания связанных с космическими полетами изменений в структуре и функции сетчатки. В текущем исследовании мышей летели на 35-дневной миссии на борту ISS, чтобы определить влияние космической среды полета на структуры глазных тканей путем количественной микроструктуры сетчатки, RPE, и хороидных слоев с помощью микро-КТ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Результаты этого исследования показали, что были структурные изменения в космическом полете мыши глаза с использованием микро-КТ техники по сравнению с группами GC, особенно сетчатки, RPE, и хороидных слоев глаза, о чем свидетельствует их снижение толщины. Micro-CT обеспечивает эффективный и неразрушаемый метод для характеристики изменений без необходимости манипуляций. Использование Окрашивания PMA повысило качество микро-КТ изображений для успешного получения четких 3D томографических изображений после реконструкции, что не говорит о необходимости физически изменять структуру образца. Дополнительным преимуществом этих изображений является то, что они отображают весь регион, представляющий интерес в цифровом виде, тем самым повышая доступность, а также воспроизводимость полученных результатов. С помощью микро-КТ изображений, сделанных в ходе этого исследования, целевой образец показал дифференциацию нескольких структур, таких как сетчатка, RPE, хороид и склера слой для определения толщины каждого слоя.
Важным шагом в протоколе является манипуляция образцами из-за их размера и текстуры. Обработка образца должна быть тщательно сделана без давления на образец во время подготовки. Микро-КТ имеет некоторые ограничения: разрешение и отсутствие стандартизированных значений для параметров. Во время сканирования различные микро-КТ сканеры могут иметь различные алгоритмы обработки изображений; однако калибровка серых масштабов может быть продолжена для преодоления любой проблемы. После сканирования, реконструкция изображений должна быть основана на ткани и анализ, который будет выполнен. Это может иметь решающее значение, так как качество изображения зависит от томографической системы, настроек, размера образца, а такжеметодов подготовки 16,,17.
Благодаря успешному применению в изучении нескольких типов нормальных и патологических тканей, возможности микро-КТ визуализации должны быть использованы в будущих исследованиях для компиляции объемных данных для других анализов. Таким образом, исходя из цели настоящего исследования, было приемлемо использовать двухмерные измерения, но сегментация валовой 3D-структуры также может быть полезной для обеспечения точного контура всего образца. Даже при всех преимуществах неразрушаемой техники, микро-КТ не заменит другие методы, такие как иммуногистохимия, но при желании дополнит и позволит продать последующий гистологический анализ.
Длительное состояние космических полетов производит ряд структурных и функциональных глазных изменений в астронавтов во время и после космической миссии определяется как SANS. Выводы включают гиперопические сдвиги, уплощение глобуса, хороидные/ сетчатки складки, и вата пятна19. В отличие от оптической слаженности астронавтов томографии (OCT) обнаружение утолщения слоя нервно-паралитического волокна сетчатки, истончение сетчатки и хороидного слоя было задокументировано в этом исследовании микро-КТ животных. Эти результаты были неожиданными. Это несоответствие может быть связано со смешанными факторами. Мыши имеют ограниченный сдвиг головоногих жидкости по сравнению с человеком. Это отсутствие изменения жидкости, возможно, вызвало различные реакции на гравитационные изменения. Во-вторых, мышей вскрыли в течение 38 часов после брызг, и острая реакция на реадаптаку может также способствовать морфологическим изменениям в сетчатке и хороиде. Подтверждение такой возможности требует дальнейших измерений во время космических полетов и долгосрочной перспективе после миссии.
Результаты этого исследования показывают, что условия космических полетов, особенно гравитационные изменения, могут вызвать острую и краткосрочную реакцию в глазу. Необходимы дальнейшие исследования для определения последствий острых изменений глаз на функции сетчатки и механизма космических полетов, вызванных изменениями структуры.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом НАСА по космической биологии No NNX15AB41G и кафедрой фундаментальных наук LLU. Суншин Чой, Деннис Левесон и Ребекка Клотц внесли значительный вклад в успех нашего исследования космических полетов, и мы высоко ценим их поддержку. Авторы также хотели бы поблагодарить всю группу НАСА Biospecimen Обмена программы за их большую помощь.
Авторы также хотели бы поблагодарить Центр стоматологических исследований за micro-CT службы.
Materials
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
- Dawson, L. The New Space Race. The Politics and Perils of Space Exploration. , 1-24 (2017).
- Mao, X. W., et al. Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue. Radiation Research. 180, 340-350 (2013).
- Overbey, E. G., et al. Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).
- Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes. Life. 4, 621-665 (2014).
- Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS). Eye. 32, 1164-1167 (2018).
- Stenger, M. B., et al. . Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).
- Garrett-Bakelman, F. E., et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight. Science. 364, (2019).
- Mader, T. H., et al. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight. Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).
- Mao, X. W., et al. Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations. Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).
- Silva, J. M. S., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Science Reports. 5, 14088 (2015).
- Descamps, E., et al. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning. Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).
- Wu, J., Yin, N. Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography. Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).
- Roque-Torres, G. D. . Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , 139-170 (2020).
- Overbey, E. G., et al. Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina. Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).
- Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones. Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease. Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).
- Lee, A. G., et al. Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update. NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).
