JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Toksisite Testi için Havadaki Parçacıklara Gerçekçi, Tekrarlanan Soluma Maruziyeti için Hava Sıvısı Arayüzü Bronşiyal Epitel Modeli

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61210
, , , , , , , , ,
1National Institute for Public Health and the Environment (RIVM), 2Institute for Risk Assessment Sciences (IRAS)

Summary

Tanımlanan, toksisite testi için parçacıklara gerçekçi, tekrarlanan inhalasyon maruziyeti için bir in vitro bronş modelinin hücre kültürü ve maruz kalma yöntemidir.

Abstract

Havadaki parçacıkların toksisite testi için, gerçekçi maruz kalma koşullarını taklit etmek amacıyla in vitro testler için hava-sıvı arayüz (ALI) maruz kalma sistemleri geliştirilmiştir. Bu, hücre kültürü modellerine özel talepler getirir. Birçok hücre tipi havaya maruz kalmaktan olumsuz etkilenir (örneğin, kuruma) ve sadece birkaç gün yaşayabilir. Bu, bu modellerde kullanılabilecek maruz kalma koşullarını sınırlar: genellikle nispeten yüksek konsantrasyonlar kısa bir süre içinde bulut (yani hızla yerleşen parçacıklar içeren damlacıklar) olarak uygulanır. Bu tür deneysel koşullar, düşük parçacık konsantrasyonlarına gerçekçi uzun süreli maruziyeti yansıtmaz. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için insan bronşiyal epitel hücre hattının kullanımı, Calu-3 araştırıldı. Bu hücreler, sağlıklı bir morfoloji ve sıkı kavşaklara sahip istikrarlı bir monolayer korurken birkaç hafta boyunca ALI koşullarında kültürlenebilir. Ek olarak, bu bronş modeli, bir ALI maruziyet sistemi kullanarak havadaki parçacıkların düşük, gerçekçi konsantrasyonlarına tekrarlanan maruziyetlerin etkilerini test etmek için uygundur. Bu sistem, bir bulut üreten tek bir nebulizasyon kullanan diğer ALI maruz kalma sistemlerinin aksine sürekli bir hava akışı kullanır. Bu nedenle, sürekli akış sistemi, partikül özelliklerini, maruz kalma konsantrasyonunu ve teslim edilen dozu sürekli izlerken havadaki parçacıklara tekrarlanan ve uzun süre maruz kalmak için uygundur. Birlikte ele alındığında, bu bronş modeli, sürekli akışa maruz kalma sistemi ile birlikte, toksisite testi için kullanılabilecek gerçekçi, tekrarlanan soluma maruz kalma koşullarını taklit edebilir.

Introduction

Akciğerler havadaki parçacıklara soluma maruziyetine karşı savunmasızdır. Havadaki parçacıkların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için, hava-sıvı arayüzü (ALI) maruz kalma sistemleri 1 , 2,3,4,5geliştirmek için ilerleme kaydedildi. ALI pozlama sistemleri, parçacıkların özelliklerini ve kinetiğini değiştiren kültür ortamı aracılığıyla geleneksel batık maruz kalma ile karşılaştırıldığında daha alakalı ve gerçekçi pozlama modellerine izin verir6. ALI maruz kalma sistemleri hücre kültürü modellerine özel taleplerde bulunuyor, çünkü modeller apikal tarafta kültür ortamından ve dolayısıyla besinlerden yoksundur. Birçok hücre modeli, kültürlü olmaktan ve havada maruz kalmaktan olumsuz etkilenir (örneğin, kurur) ve sadece birkaç gün yaşayabilir kalır. Bu, bu modellerde kullanılabilecek maruz kalma koşullarını sınırlar: genellikle nispeten yüksek konsantrasyonlar bir bulut olarak kısa bir süre içinde uygulanır (yani, hızla yerleşen parçacıklar içeren damlacıklar). Bu tür deneysel koşullar, düşük parçacık konsantrasyonlarına gerçekçi uzun süreli maruziyeti yansıtmaz; böylece sonuçların ilgisi sorgulanabilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, calu-37 insan bronş epitel hücre hattından oluşan bir bronş modeli için kültür ve maruz kalma protokolü optimize edildi.

ALI maruziyeti için kullanılan in vitro akciğer modellerinin çoğu, temel olarak A549, BEAS-2B ve 16HBE14o- (16HBE) veya birincil hücreler gibi diğer hücre çizgileriniiçerir. Bu hücre hatları, ALI’de kültürlendiğinde sadece birkaç gün yaşayabilir kalmaları dezavantajlarına sahiptir. Ek olarak, bu hücre çizgilerinin bazıları 5 günden daha uzun bir süre kültürlendiğinde aşırı büyür. Son olarak, A549 hücreleri fonksiyonel sıkı kavşakları kaçırır ve bu nedenle akciğerleri taklit etmek için gereken sıkı bir bariyer oluşturamaz9,10. Birincil epitel hücreleri, ALI’de haftalarca kültürlenebildiği için ALI maruziyeti için iyi bir seçenek olabilir. Bununla birlikte, birincil hücreler topludan topluya farklılık gösterir, bakımı daha zordur ve hücre hatlarına kıyasla daha pahalıdır, bu da onları toksisite testi ve taraması için daha az uygun hale getirir. Farklı insan bronşiyal epitel hücre hatlarını (16HBE, Calu-3, H292 ve BEAS-2B) karşılaştırırken, sadece Calu-3 hücreleri gerçekçi, tekrarlanan ALI maruziyeti için gereken tüm kriterleri yerine getirmektedir: ALI’de kültürlüyken haftalarca yaşayabilir kalırlar, yüksek bariyer bütünlüğü sağlarlar, aşırı büyümezler ve kültürlenmesi ve sürdürülmesi kolaydır. Calu-3 hücreleri bir adenokarsinomdan kaynaklanır ve mukusüretebilir 11,12. Hücrelerin cilia11,13geliştirip geliştiremeyeceği konusunda tutarsızlıklar vardır. Calu-3 hücreleri ayrıca siliated hava yolu epitel hücrelerini enfekte eden solunum yolu senktiyal virüs (RSV) enfeksiyonlarını incelemek için uygun bir modeldir14.

Hücre modelinin yanı sıra, aerosollere hava-sıvı maruziyeti için otomatik pozlama sistemi (AES) kullanılır15,16. AES, hücre modelini aerosollere maruz bırakmak için sürekli bir hava akışı kullanma avantajına sahiptir. Bu, genellikle bulut olarak kısa bir süre içinde nispeten yüksek konsantrasyonlar kullanan diğer hava-sıvı maruziyet sistemlerinin aksine (yani, hızla yerleşen parçacıklar içeren damlacıklar)17,18,19. Bu bulut sistemleri, düşük parçacık konsantrasyonlarına gerçekçi uzun süreli maruziyeti yansıtmaz. AES kullanılarak sürekli bir hava akışı uygulanarak, hücre modeli daha uzun bir süre boyunca düşük bir parçacık konsantrasyonuna maruz kalabilir ve gerçekçi maruz kalma koşullarını yansıtabilir. Bulut sistemlerine göre bir diğer avantaj, AES’nin parçacık karakterizasyon araçlarını bağlama seçeneğine sahip olması ve zaman içinde parçacık boyutunun, sayı konsantrasyonunun ve kütlenin ölçülemesine izin vermesidir. AES’nin bir sınırlaması, 10 mL / dk ile 100 mL / dk arasında nispeten yüksek hava akışları kullanmasıdır.

Protocol

1. Hücre kültürü ortamının hazırlanması (CCM) Glutamin ile desteklenmiş 500 mL minimum esansiyel ortam (MEM) şişesi hazırlayın. 5 mL penisilin-streptomisilin ekleyin (yani, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisilin). 5 mL esansiyel olmayan amino asit (NEAA) çözeltisi ekleyin. 10 mL amfoterikin B ekleyin (isteğe bağlı). 50 mL FBS ekleyin (ısı inaktive, ısı inaktivasyonu için lütfen ATCC protokolünü izleyin; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/CultureGuides/AnimCellCulture_Guide.ashx, sayfa 19)). 2. Calu-3 hücrelerinin alt kültürü NOT: Calu-3 hücreleri T75 veya T175 hücre kültürü şişelerinde 37 °C ve% 5 CO2’dekültürlenir. Hücreler her 7 günde bir -80 oranında, CCM yenilemesi ile her 2-3 günde bir geçiştirilir. CCM dökülür ve taze CCM (T25 = 5 mL, T75 = 15 mL ve T175 = 25 mL) şişeye borulanır ve şişe tekrar inkübatöre yerleştirilir. Hücreler çözdükten sonra, deneylerde kullanmadan önce veya donmadan önce en az 2 kat geçmeli ve toplamda en fazla 25x geçilmelidir. Hafif bir mikroskop altında kontrol ingerek şişenin % 60-80 bir arada olup olmadığını onaylayın. CCM’i şişeden dökün. Hücreleri 5 mL 1x Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile kalsiyumsuz ve magnezyumsuz 2x yıkayın. Her yıkamadan sonra HBSS’yi atın. HBSS, tripsin inhibe eden serumu çıkarır. Bir T75 için 3 mL tripsin-EDTA ekleyin (T175 için 4 mL) ve şişeyi 37 °C’de inkübatöre ve 10-15 dakika boyunca% 5 CO2’ye yerleştirin. 10 dakika sonra kontrol edin, hücrelerin şişe yüzeyinden ayrıldığından emin olun. Hücrelerin %0,05 trypsin kullanılarak ayrılmayacakları ve %0,25 trypsin kullanılabileceği durumlarda hücreler izne çıkar. Şişeye 6 mL (yani, başlangıçta eklenen tripsin-EDTA hacminin iki katı) ekleyin ve uygun karıştırmayı sağlamak için şişeleri hafifçe sallayın. Bu, tripinin CCM’deki FBS tarafından nötralize edildiğini ve hücreler üzerindeki aktivitesinin durdurulduğunu sağlamaktır. Tripsin’in hücrelerle çok uzun süre temas halinde kalmasına izin verilirse, yeni bir hücre kültürü şişesine konduğunda yeniden bağlanmazlar. Şişenin tüm içeriğini 50 mL santrifüj tüpüne dökün. Hücreleri 5 dakika boyunca 130 x g’dasantrifüjün doğru dengelenmesini sağlayın. Hücreleri içeren şişeyi aseptik koşullara geri döndürün ve peleti bozmadan süpernatantı nazikçe çıkarın. Süpernatant dökülebilir ve geri kalanı pipetle kapatılarak peletin bozulmaması sağlanır. Tüm hücreler askıya alınana kadar (yani, pelet veya hücre aglomeraları gözlenmedi) yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini 1 mL CCM’de yeniden depolar. Hücre süspansiyonu seyreltmek için ek CCM eklenebilir. Hemositometre kullanarak 1 mL CCM’de hem ölü hem de canlı hücreleri sayın. Doğru sayım için gerekirse, hücreleri 3 veya 4 mL’de seyreltin. Hücreleri gerekli CCM hacmine askıya alın ve hücre süspansiyonu her şişeye ekleyin. Bir haftada yaklaşık% 80 izdiah elde etmek için, bir T75’teki tohum 2 x10 6 hücre veya bir T175’teki 6 x10 6 hücre. Şişeyi hafifçe sallayın ve ardından 37 °C ve% 5 CO2’deinkübatöre geri yerleştirin. Her 2-3 günde bir taze CCM ve hücreler -80 izdiah süresine ulaştığında alt kültür ile değiştirin. 3. Calu-3 hücrelerini kültür kesici uçlarına tohumlama NOT: Kesici uçlar farklı gözenek boyutlarıyla mevcuttur. Küçük gözenek boyutları (örneğin, 0,4 μm), hücrelerin daha kolay büyümesi ve Trans Epitel Elektrik Direnci (TEER) ile ölçüldüğü gibi, su altında 5 gün kültlemeden sonra zaten iyi bir bariyer elde etme avantajına sahiptir. Bununla birlikte, parçacık translokasyonu ile ilgilendiğinde, bu gözenekler çok küçüktür ve parçacıkları hapsedecektir. Bu nedenle, parçacıkları test etmek için genellikle daha büyük gözenek boyutları (örneğin, 3 μm) seçilir. Daha büyük bir gözenek boyutu kullanırken, hücrelerin iyi bir TEER elde etmek için daha uzun zaman aralıklarına (örneğin, su altında 7-10 gün kültleme) ihtiyacı vardır. 2.1–2.10 adımlarını izleyerek hücre süspansiyonu bilinen konsantrasyonla hazırlayın. 6 iyi kesici uç için önceden ısıtılan CCM’de hücreleri 5 x10 5 hücre/mL konsantrasyonda seyreltin veya 12 kuyu kesici uç için2,5 x 10 5 hücre/mL. Kesici uçlu bir hücre kültürü plakası alın ve aseptik koşullar altında yerleştirin. Beşayıl tarafı 6 kuyu kesici uç için 2 mL önceden ısıtılmış CCM veya 12 kuyu ucu için 1 mL ile doldurun. Kültür ortamını eklerken, cımbız kullanarak kesici ucu dışarı alın. Hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleme ile dikkatlice karıştırın. 0,4 μm gözenekli hücre kültürü kesici uçtaki zarın üstünde 6 kuyu kesici uç için pipet 1,0 mL ve 12 kuyu kesici ucu için 500 μL (100.000 hücre/cm2’ye eşdeğer). 3.0 μm gözenekler için hücre yoğunluğunu 128.000 hücre/cm2’yeçıkarın. Hücre kültürü plakasını örtün ve 37 °C ve% 5 CO 2’de kuluçkayayatırın. CCM’i her 2-3 günde bir değiştirin. ALI’de kültüre devam etmeden önce hücrelerin su altında 7 gün boyunca bir araya gelmesine izin verin. TEER’i ölçün. Chopstick Elektrot Seti ile desteklenmiş bir Epitel Voltohmmeter alın ve pil sistemini gece boyunca şarj edin. Voltohmmeter’ı şarj cihazından çıkarın ve çubuk elektrot’u bağlayın. Elektrot etanol ile temizleyin. Elektrodu, yemeğin dibine değene kadar dış kültür ortamına koyarak ve daha kısa elektrodu zara dokunmadan ortama koyarak CCM’ye yerleştirin. Hücresiz boş bir kesici uçla başlayın. Ölçüm stabilize olana kadar bekleyin ve Ohms’daki direnci yazın. Bu ölçüm, kesici uç zarının herhangi bir hücresi olmadan (yani boş direnç) direncidir. Her kesici uç için ölçümü tekrarlayın ve gerçek direnci elde etmek için boş direnci çıkarın. Veri analizi için, direnç değerlerini kesici ucun yüzey alanıyla Ω x cm2’yeçarpın. 6 iyi kesici uç için yüzey alanı 4,67 cm2’dir. Bu nedenle, 600 Ohm’luk bir direnç ölçülürse ve arka plan 120 Ohm ise, direnç 480 Ohm’dir, bu da toplam2.241.6 Ohm xcm2 için 4.67 cm 2 yüzey alanı ile çarpılır. DEVAM ETMEK için TEER >1.000 Ω x cm2 olmalıdır. CCM’yi kesici uçların apikal tarafından çıkarın. Kuyunun bazolateral tarafına (yani hücre kültürü kesici ucunun altına) 6 kuyu için 2 mL önceden ısıtilmiş CCM ve 12 kuyu ucu için 1 mL ekleyin. CCM zara alttan dokunmalı, ancak kesici ucun üstüne sızmamalıdır. Bu noktada hücreler, ALI’de kültleme olarak adlandırılan havaya aptik olarak maruz kalırlar. Maruz kalmadan önce 7 gün boyunca 37 °C ve %5 CO2’de inkübatördeki ALI’deki kültür hücreleri. Bazolateral CCM’yi her 2-3 günde bir değiştirin. Hücreler ALİ’de 6 hafta boyunca kullanılabilir. 4. Pozlama kurulumunu hazırlama NOT: Bölüm 5-7, otomatik pozlama istasyonu kullanarak partikül maruziyeti için preparatları açıklar (AES, bkz. Malzeme Tablosu). Parçacık nebülizasyonu ve karakterizasyonu kurulumu, diğer üreticilerin diğer ALI maruz kalma sistemleriyle de uyumludur. Örnek olarak, parçacıklara maruz kalma aşağıda açıklanmıştır. Bu tür sistemler, duyarlılaştırıcılar, sigara dumanı ve dizel egzoz gibi diğer pozlamalar için de kullanılabilir. Şekil 1’de AES ve pozlama modülü gösterilir. Şekil 2, diğer tüm araçlar da dahil olmak üzere pozlama kurulumunun şematik bir gösterimini gösterir. AES’yi kullanarak pozlamayı başlatmadan önce, aerosol özelliklerini ölçmek için sistemi birkaç cihaza bağlayın; bunlar aerosoller kabine girmeden hemen önce bir yan akışta ölçülür.NOT: Yan akışı pozlama karakterizasyon ekipmanına bağlamak için bir akış ayırıcı kullanılır. Genellikle, aşağıdaki ekipman kullanılır: tarama hareketliliği parçacık boyutlandırıcı (SMPS), optik parçacık boyutlandırıcı (OPS), yoğuşma parçacık sayacı (TBM), konik eleman salınımlı mikro denge (TEOM). SMPS ve OPS ölçümleri saatte 1 kat yapılır ve akış ayırıcıdan aynı boruyu kullanır. TBM ve TEOM sürekli ölçüm gerçekleştirir ve her ikisinden de gelen veriler bir Squirrel model 2020 veri kaydedicisinde günlüğe kaydedilir. Ek olarak, gravimetrik kütle konsantrasyonu kontrollü bağıl nemde bir mikro denge kullanılarak belirlenir (-70) ve sıcaklık (21–23 °C) koşulları. Teflon filtreler, maruz kalma konsantrasyonu doğrulamak için her pozlamadan önce ve sonra tartılmıştır. Egzozun yakalanması için HEPA filtresi kullanılır. Tasarlanmış nanomalzeme (ENM) süspansiyonlar ve nebülizör de dahil olmak üzere kurulum, insanlara maruz kalmayı önlemek için bir akış kabinine yerleştirilir. AES, metaller ve metal oksitler de dahil olmak üzere birçok farklı ENM türünü test etmek için kullanılabilir. Pozlamadan kısa bir süre önce nanomalzeme süspansiyon hazırlayın. Genellikle% 1 süspansiyon stok çözümü olarak hazırlanır. Örneğin, 10 mL saf suda 100 mg nanomalzeme askıya alın.NOT: DQ12 maruziyeti için, yaklaşık 2 μg /cm2 elde etmek için 300 mg kullanılır. Bu miktar tek bir pozlamada kullanılabilir veya tekrarlanan pozlamalara bölünebilir (örneğin, 300 mg tek bir pozlama için 30 mL’de askıya alınır veya 21,5 mg 3 haftalık tekrarlanan maruz kalma için her gün taze olarak 2,15 mL’de askıya alınır). Süspansiyon her pozlama gününde yeni hazırlanır. Parçacık süspansiyonu, prob sonikasyonu kullanılarak 16 dakika boyunca sonicated edilir. %1 stok çözeltisinin hacmi saf su eklenerek toplam 100 mL hacme ayarlanır. Enm süspansiyonu, parçacıkların yerleşmesini önlemek için kapaklı ve manyetik karıştırıcılı küçük bir şişeye koyun. Şişeyi küçük bir tüple peristaltik bir pompaya bağlayın ve akışı 25 mL / s’ye ayarlayın. Peristaltik pompayı bir püskürtme nozülüne bağlayın ve sürekli aerosolizasyona izin vermek için ayarları yapın. Püskürtme nozülü 60 cm uzunluğunda bir alüminyum boruya monte edilir (karıştırma odası, çapı 15 cm, 60 °C’ye ısıtılır). Kurulum, AES’e 1,5 metre uzunluğunda bakır boru (çapı 15 cm) ile bağlanır. AES’in üstünde bir impactor, 2,5 μm’den büyük tüm aerosolleri kaldırır. Süspansiyonların nebulizasyonuna izin vermek için püskürtme nozulunu iki kütle akış kontrolörü (MFC) aracılığıyla 3 çubuk basınçlı havaya bağlayın. Sprey nozul için 14 L/dk’lik bir akış, diğer MFC ise tüpteki havanın karıştırılması için kullanılır. Maruz kalmanın başlamasından bir gün önce, kabinin 37 ° C sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için AES’yi açın. neme ulaşmak için maruz kalma başlamadan 2 saat önce hava akışını ve kabindeki nemi açın. Hücrelerle kesici uçların yerleştirileceği maruz kalma odalarının ısıtılmasını açın. Kuvars mikro dengesini (QCM) açın ve yazılımı kullanarak başlangıç değerini 0 olarak ayarlayın. Günlüğe kaydetmeye başlayın. Her 10 sn’de bir kütle ölçülür ve ng/cm2olarak ifade edilir. Bir su banyosunda (~20-30 dk) hücre kültürü ortamını 37 °C’ye ısıtın. 5. Calu-3 hücrelerini maruz kalmaya hazırlama NOT: AES kullanarak tipik bir ALI pozlaması için, birleştiği hücre katmanına sahip 15-20 kesici uç gerekir. Bunlar 3 temiz hava kontrolü, AES’de maruz kalmadan diğer kesici uçlara benzer şekilde ele alınacak 3 inkübatör kontrolü, aerosol maruziyeti için 6-8 kesici uç (0, 1 veya 2 mikro denge kullanımına bağlı olarak), kontrol ölçümleri için 1-3 kesici uçtan (maksimum LDH salınımı gibi) ve bazı kesici uçların TEER’inin yeterli olmaması durumunda 3 yedek kesici uçtan oluşur. Hücrelerin devam etmesi için >1.000 Ω x cm2 TEER’i olmalıdır. Maruz kalmanın ilk gününde, hücreleri CCM ile 1x yıkayın, hücre morfolojisini kontrol edin ve bir Voltohmmetre kullanarak hücre modelinin TEER’ini ölçün. Hücreler boşluksuz sıkı bir monolayer oluşturmalıdır. FCS’siz 2 mL/1 mL’lik HEPES tamponlu CCM’yi 6 kuyu/12 kuyu plakasının bazolateral tarafına koyun ve hücreli kültür kesici uçlarını yeni plakalara aktarın.NOT: Maruz kalma sırasında AES’de CO2 yoktur. Bu nedenle, taşıma ve maruz kalma sırasında HEPES tamponlu kültür ortamı (25 mM HEPES) kullanılır. Bu ortam hem AES’deki maruz kalan hücreler hem de inkübatör kontrol hücreleri için kullanılır. Hücre kültürlerini AES’ye taşıma süresinin 5 dakikadan fazla olması durumunda, hücreleri taşıma sırasında 37 °C’lik taşınabilir bir inkübatöre koyun. 6. Pozlama sırasında AES’nin ele alınması AES’de, fetal baldır serumu (FCS) olmadan maruz kalma modüllerini HEPES tamponlu CCM ile doldurun. CCM miktarı kullanılan birime ve hücre kültürü ekleme türüne bağlıdır. Hücreleri ALI’de tutmak için ortamın zarın dibine ulaşması gerektiğini, ancak zarın üstüne sızmaması gerektiğini unutmayın. 6 iyi kesici uç kullanırken, pozlama modüllerine 6 mL HEPES arabelleğe alınmış CCM ekleyin. Hücreli kesici uçları steril cımbız kullanarak plakalardan pozlama modüllerine aktarın. Hücrelerin bazolateral tarafında hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin ve kesici uçların apikal tarafındaki herhangi bir CCM’yi çıkarın. Bazolateral tarafta bazı hava kabarcıkları olması durumunda, steril cımbızları kullanarak uçları çıkarılana kadar hafifçe çevirin. CCM içeren plakaları, maruziyetten sonra transfer için bir inkübatörde tutun. Pozlama süresini, hava akış hızını ve elektrostatik biriktirme geliştirmeyi seçmek için dokunmatik ekran kullanın. Ekran nem ve sıcaklığı kontrol etmek için de kullanılabilir. Genellikle, 37 ° C’deki kesici uçlarda 50 mL / dk akış hızı ve% 85 nem ile 4 saat maruz kalma süresi seçilir.NOT: Birinci seviyedeki modüller (Şekil 1) temiz hava maruziyeti için kullanılır; bu seviyedeki kesici uçlar temiz hava maruziyeti kontrolleri olarak kullanılır. İkinci ve üçüncü seviyedeki diğer modüller, çevrimiçi biriktirmeyi ölçmek için kuvars kristal mikro dengeleri (QCM) için iki modül de dahil olmak üzere aerosol maruziyeti için kullanılabilir. Sızıntı testi maruz kalmaya başlamadan önce yapılmalıdır. Sızıntının 5 mL/dk’dan az olması gerekir. AES ekranındaki yönergeleri izleyin. Sızıntı testi tamamlandığında, pozlama başlatılabilir. Bir sızıntı durumunda, boru kontrol edilmelidir. Pozlamanın sonunda, bir AES modülünün kapısını açın, pozlama modüllerini açın, hücre kültürü kesici uçlarını hücre kültürü plakalarına geri yerleştirin ve plakaları taşınabilir inkübatöre aktarın. Lactate dehidrogenaz (LDH) ölçümü gibi daha sonraki analizler için ortamları modüllerden (yani maruz kalan örneklerden) ve plakalardan (yani inkübatör kontrollerinden) toplayın. Hücre kültürü laboratuvarında, hücre kültürü kesici uçlarını taze standart CCM ile dolu plakalara aktarın. Hücre kültürü plakalarını bir sonraki pozlama veya analize kadar inkübatöre koyun. Son pozlama gününden sonra, kesici uçları ertesi güne kadar inkübatöre yerleştirin. Son pozlamadan sonraki gün, Bir Voltohmmeter kullanarak TEER’i ölçmek için apikal tarafa CCM ekleyin. Sitokinlerin analizi için hem apikal hem de bazolateral CCM’yi ayrı ayrı toplayın. Tüm CCM’yi çıkarın ve örneğin apikal tarafa bir çoğalma reaktifi ekleyerek bir hücre canlılığı tahlilini gerçekleştirin. 7. AES’nin Temizlenmesi Pozlama modüllerini suyla doldurun, 1 dakika bekleyin ve suyu çıkarın. Daha sonra, modülleri% 70 etanol ile doldurun, 10 dakika bekletin ve etanolleri çıkarın. Maruz kalma trompetlerini de% 70 etanol ile temizleyin. % 85 nem kontrolünü durdurun, ancak bir sonraki deney için kabinin sıcaklığını 37 ° C’de bırakın.

Representative Results

Bu makale, ALI’deki insan bronşiyal epitel hücrelerini kültleme ve maruz bırakma için toksisite testi için kullanılabilecek gerçekçi, tekrarlanan soluma maruz kalma koşullarını taklit eden bir yöntem sunmaktadır. Hem hücre modelinin hem de maruz kalma sisteminin özellikleri, tekrarlanan pozlamalar için kullanılabilecek gerçekçi bir soluma maruz kalma modeli elde etmek için gereklidir. Bu özelliklerle ilgili sonuçlar aşağıda gösterilmiştir. Hücre modeli gereksinimleri ve seçimi Uygun bir hücre modeli seçerken, aşağıdaki özellikler dikkate alınmalıdır: Hücre modeli, akciğer bariyerini taklit etmek için çalışan sıkı kavşaklara sahip bir konfluent monolayer oluşturabilmelidir. Hücre modeli, koşullandırılmış (sıcaklık ve nem) havaya tekrar tekrar maruz kaldığında optimum performans göstermelidir. Hücre modeli bir pozlama yanıt vermelidir. Bu çalışma dört farklı insan bronşiyal epitel hücre hattı ile başladı: 16HBE, Calu-3, H292 ve BEAS-2B. Bunların hepsi nanomalzemelerin ve kimyasalların toksisite testi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Dört hücre hattından sadece Calu-3 hücreleri yukarıdaki tüm gereksinimleri karşılamıştır. Hücreler, TEER tarafından ölçülen zaman içinde sabit bir bariyer olarak kalan sıkı kavşaklara sahip bir monolayer oluşturmuştur (Şekil 3), diğer hücre hatları ise ya bir bariyer oluşturmamıştır ya da ALI’de kültürlendiğinde bariyer fonksiyonunda bir düşüş göstermiştir (Şekil 4). Buna ek olarak, H292 ve BEAS-2B, daha uzun bir süre kültürlendiğinde birden fazla hücre katmanına aşırı büyüme eğiliminde oldu. Geleneksel sualtı hücre kültörü ve ALI kültüring büyük ölçüde farklılık gösterdi, çünkü ALI’de besinler sadece bazolateral taraftan mevcuttu ve hücreler apikal tarafta kuru koşullara maruz kaldı. Bu durumlar hücre modellerinde strese neden olabilir ve bu da zaman içinde hücre canlılığını ölçerek gözlenebilir. Hücre hatları 16HBE, H292 ve BEAS-2B, ALI’de kültürlendiğinde artmış bir LDH salınımı gösterirken, Calu-3 hücreleri sadece hafif bir LDH salınımı gösterdi (Şekil 5). Daha sonra, Calu-3 modelinin maddelere yanıtı test edildi. Pozitif kontrol maddesi olarak LPS, modelin apikal tarafına nebulizasyon yoluyla uygulandı. Biriken doz 0.25 μg/cm2idi. Calu-3 hücreleri, LDH salınımında ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) salınımında artarak lipopolisakkarit (LPS) reaksiyonu göstermiştir (Şekil 6). Son olarak, Calu-3 monolayer kuvars silika (DQ12) nanomalzemelere (IOM, Edinburgh) maruz kaldı. Kristal silika silikozu indükleyebilir ve akciğer tümörlerine de neden olabilir. Bu nedenle, Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (IARC) kristal silikayı Grup I insankanserojeni 20olarak sınıflandırmıştır. Kristal silikanın etki mekanizmasının, reaktif yüzeyi21 , 22,23’ün neden olduğu kalıcı iltihabın indüksiyonu ile olduğu düşünülmektedir. Hem sıçanlarda hem de farelerde yapılan çeşitli in vivo çalışmalar, kristal silika 24 , 25 ,26,27 , 28,29’asoluma maruziyeti sonrası tümörler ve fibrozis de dahil olmak üzere inflamasyon ve histopatoloji değişikliklerinin indüksiyonunu rapor eder. Bu etkilerin tümü tekrarlanan maruziyet ve/veya uzun süreli takiplerden sonra gözlenir. Calu-3 modeli, in vivo çalışmalardan elde edilen gözlemlerin ALI’de tekrar tekrar ortaya çıkılabilen bir in vitro model kullanılarak taklit edilip edilemeyeceğini araştırmak için kullanıldı. Calu-3 hücreleri art arda 3 hafta, haftada 5 gün, DQ12’ye günde 4 saat maruz kaldı. Biriken doz QCM kullanılarak ölçüldü. Ortalama birikmiş doz günde 120 ng / cm2 idi, kümülatif doz 1.6 μg / cm2, in vivo bir etkiye neden olan dozlara benzer. Diğer parçacık özellikleri Tablo 1’degösterilmiştir. 3 haftalık maruziyetten sonra, DQ12 teer, hücre canlılığı ve monosit kemoattraktant protein 1 (MCP-1) salınımında temiz hava kontrollerine kıyasla önemli bir etki yaratmadı (Şekil 7). In vivo verilere dayanarak DQ12’nin daha fazla toksisitesi beklendiğinden, AB projesi GRACIOUS (teslim edilebilir 5.3) içinde optimize edilen protokole göre hücresel bir test kullanılarak parçacıkların reaktivitesi kontrol edildi. DQ12 grubunun reaktivitesi beklenenden daha düşüktü (Şekil 8), pozitif kontrol parçacıkları karbon siyahı (CB) ile karşılaştırıldığında büyüklük sıraları daha düşüktü. Bu reaktivite eksikliği Calu-3 modelinde toksisite yanıtının olmamasını açıklayabilir. Şekil 1: Otomatik pozlama istasyonu (AES).Sol figür dokunmatik panel ile kabinin dışını gösterir. AES’in pozlama modüllerine sahip üç seviyesi vardır: temiz hava maruziyetleri için en üst seviye ve aerosol maruziyetleri için orta ve alt seviye. Doğru şekil, hücreli kesici uçların yerleştirildiği pozlama modülünü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Pozlama kurulumunun şematik gösterimi.Soldan sağa: 1) peristaltik bir pompa ile püskürtme nozüle bağlı ENM süspansiyonu; 2) Basınçlı hava kullanarak sprey nozül ENM süspansiyonu nebulize eder ve bir karıştırma odası aracılığıyla aerosoller AES’ye yönlendirilir; 3) AES’ye girmeden hemen önce aerosol karakterizasyon cihazları bağlanır: SMPS, OPS, TBM ve TEOM. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: 10 gün boyunca hava sıvısı arayüzünde (ALI) kültlemeden sonra Calu-3 hücrelerinin temsili görüntüsü.10 gün boyunca ALI’de kültlendikten sonra Calu-3 hücrelerinin floresan mikroskopi görüntüsü. Sıkı bağlantı proteini ZO-1 yeşile boyanır, hücrelerin çekirdekleri maviye boyanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: 21 günlük bir kültür döneminde dört farklı hücre hattının transepithelial elektrik direnci (TEER).21 gün boyunca kültürlendiğinde 16HBE, Calu-3, H292 ve BEAS-2B TEER değerleri: ilk 7 gün suya gömüldü, ardından ALI’de 14 gün. TEER değerleri kesici ucun arka plan direnci için düzeltildi ve kesici ucun yüzey alanıyla çarpıldı. Semboller ve hata çubukları, altı kesici ucun ortalama değerini ve standart sapmasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: 21 günlük bir kültür döneminde dört farklı hücre hattının LDH salınımı.21 gün kültürlendiğinde 16HBE, Calu-3, H292 ve BEAS-2B’nin LDH sürümü: 7 gün su altında kaldı, ardından ALI’de 14 gün. Gösterilen LDH değerleri, hücre türü başına en fazla LDH salınımı ile göredir. Semboller ve hata çubukları, beş kesici ucun ortalama değerini ve standart sapmasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: LPS’ye maruz kalan Calu-3 hücrelerinde hücresel etkiler.Calu-3 hücreleri bulut nebülizasyonu ile 0.25 μg/cm2 LPS’ye maruz kaldı. (A) WST-1 dönüştürmesi. (B) LDH sürümü. (C) LPS maruziyeti sonrası TNF-α serbest bırakır. Semboller ve hata çubukları, üç kesici ucun ortalama değerlerini ve standart sapmalarını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: DQ12 nanomalzemelere maruz kalan Calu-3 hücrelerinde hücresel etkiler.Calu-3 hücreleri DQ12 nanomalzemelere 3 hafta (günde 4 saat, haftada 5 gün), günde yaklaşık 120 ng/ cm2, kümülatif doz 1.6 μg / cm2maruz kaldı. (A) TEER değerleri. (B) LDH sürümü. (C) DQ12 pozlamadan sonra MCP-1 sürümü. Tüm semboller ve hata çubukları, denetimler için üç kesici ucun ve DQ12 pozlaması için altı kesici ucun ortalama değerlerini ve standart sapmalarını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: DQ12’nin hücresel reaktivitesi.DQ12, yüzey reaktivitesini tespit etmek için 2ʹ.7ʹ-Dichlorofluorescein Diasetat (DCFH-DA) probu ile inkübe edildi. Pozitif kontrol olarak karbon siyahı (CB) partikülleri dahil edildi. CB ile karşılaştırıldığında, DQ12 çok düşük yüzey reaktivitesine sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Parçacık kütlesi (μg/m3) Parçacık numarası (#/cm3) Hareketlilik parçacık boyutu (nm) Geometrik standart sapma Optik parçacık boyutu (μm) 2969 (418) 83983 (10215) 66.6 2.5 1.1 (1.3) Tablo 1: DQ12 pozlama özellikleri. Değerler, parantez içinde standart sapma ile ortalama olarak gösterilir.

Discussion

Bu makalede, ALI altında insan bronşiyal epitel hücrelerini kültleme ve bu bronş modelini aerosollere veya gazlara maruz kalma yöntemi açıklanmaktadır. Calu-3 hücrelerini kullanmanın avantajı, sıkı kavşaklar oluşturmaları, monolayer kalmaları, hava akışına dayanabilmeleri ve diğer birçok hücre tipinin (örneğin, 16HBE, H292 ve BEAS-2B) aksine, ALI’de haftalarca kültürlenebilmeleridir. VITROCELL® otomatik pozlama istasyonunun (AES) kullanılması, sürekli bir hava akışı kullanılarak düşük konsantrasyonlar uygulanabildiğinden hücrelerin gerçekçi ve ilgili koşullar altında maruz kalabilmesi avantajına sahiptir.

AES gibi sürekli akış sistemleri, bir süspansiyonun tek bir nebulizasyonunu kullanan bulut sistemleri3,32‘yi kullanmaya kıyasla avantajlara sahiptir. Sürekli akış daha gerçekçidir ve akış hızı, nem ve sıcaklık gibi birçok değişken kontrol edilir. Ek olarak, biriktirme bir elektrik alanı kullanılarak geliştirilebilir. Son olarak, boyut, sayı konsantrasyonu ve kütle gibi aerosol özellikleri çevrimiçi olarak izlenir. Bir dezavantaj, devam eden akış sistemlerinin bulut sistemlerine kıyasla daha karmaşık olmasıdır. Bu nedenle, aerosolun parçacık özelliklerine ve kesici uçta teslim edilen doza odaklanan hazırlık deneyleri yapmak önemlidir. Parçacıkların ilk başlangıç konsantrasyonu ve AES ayarları daha sonra hücrelerde istenen dozu elde etmek için ayarlanabilir33. Test edilen parçacıkların türüne bağlı olarak, aerosol oluşturma yöntemi farklılık gösterebilir. Elektrostatik biriktirmenin kullanımı parçacık tipine bağlıdır ve metalik parçacıklar için en iyi şekilde çalışır. Pozitif yüzey yükü olan parçacıklar için negatif bir elektrostatik alan uygulanmalıdır ve bunun tersi de geçerli olmalıdır.

Maruz kalma konsantrasyonlarının seçimi herhangi bir hava-sıvı maruz kalma deneyi için zor olabilir. DQ12 maruziyetleri için amaç, 3 haftalık maruziyetin ardından haftada 5 gün, günde 4 saat olmak üzere toplam 1 μg/cm2 kümülatif doz elde etmekti. Bu doz vivo21 , 25 , 27,32,33bir etki indükleyen dozlara benzer. Pozlamaları gerçekleştirirken, farklı maruz kalma günleri arasında bazı farklılıklar vardı. 1.6 μg/cm2’lik gerçek yatırılmış doz hedeflenen 1 μg/cm2’den daha yüksek olmasına rağmen, doz Calu-3 modelinde etkileri gözlemlemek için çok düşük olabilir. Temiz hava maruziyeti ile DQ12 maruziyeti arasında teer, canlılık ve sitokin yanıtında sadece küçük farklılıklar gözlendi ve bu farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi. DQ12’nin 3 hafta boyunca maruz kalmasının Calu-3 hücrelerinde önemli etkiler yaratmadığı gözleminin bir açıklaması, makrofajların Calu-3 modelinden yoksun olduğudur. Muhtemelen, DQ12’den sonra makrofajlar Calu-3 hücrelerini etkileyebilecek proinflamatuar sitokinler üretir. Başka bir açıklama, deneyler için kullanılan DQ12 toplu işleminin beklendiği kadar reaktif olmamasıdır. LPS’yi pozitif kontrol maddesi olarak kullanırken Calu-3, LDH salınımındaki artış ve TNF-α salınımındaki artışla ölçülen bir yanıt gösterir. Bu, modelin toksisiteyi algılayabileceğini gösterir.

Calu-3 hücre modelinin sonuçlar bölümünde tartışıldığı gibi birçok avantajı vardır. Ayrıca, ALI’de daha uzun süre kültürlendiğinde, Calu-3 hücreleri cilia / cilia benzeri yapıları13 büyüyebilir ve mukus11 , 12,13üretebilir. Bu avantajlara rağmen, modelin fizyolojik ilgisi ile ilgili sınırlamaları vardır. Calu-3 hücre hatları adenokarsinomdan kaynaklanırken, 16HBE ve BEAS-2B sağlıklı dokudan kaynaklanır. Ne yazık ki, ikinci ikisi zaman içinde istikrarlı bir monolayer olarak kalmadıkları için tekrarlanan ALI maruziyeti için uygun değildir. Calu-3 modelinin bir başka sınırlaması, yalnızca tek bir hücre türünü temsil ediyor olmasıdır. İnsan akciğerinde, maruziyete farklı şekilde etkileşime giren ve yanıt veren birden fazla hücre tipi mevcuttur. Solunan parçacıklar aerodinamik boyutlarına bağlı olarak akciğerlerin farklı bölgelerinde birikecektir. Calu-3 modeli tarafından taklit edildiği gibi, parçacıkların epitel hücre bariyeri ile temas ettiği yer burasıdır. İnsan akciğerinde, alveoler makrofajlar parçacıklara çekilir, onları sarar ve akciğerlerden temizler. Makrofajlar ayrıca partikül maruziyetine enflamasyon yanıtında da önemli bir rol oynar. Bu nedenle akciğer bariyerini daha yakından taklit etmek için birincil makrofajlar eklenerek Calu-3 modelinin genişletilmesi için çalışmalar yapılmaktadır. Makrofajların dezavantajı, ALI’deki Calu-3 hücrelerinin üstünde kültürlendiğinde sadece yaklaşık 7 gün yaşayabilir kalmalarıdır. Bu nedenle, makrofajlar mevcut Calu-3 modelini bir kokültür modeline dönüştürmek için haftalık olarak okunmalıdır. Ortak kültür protokolünün optimizasyonu şu anda devam etmektedir.

Yukarıdakiler göz önüne alındığında, Calu-3 bronş modeli, sigara dumanı ve LPS’den elde edilen kimyasallar gibi kısmen çözünür maddelerin aerosollerine tekrar tekrar maruz kalmak için uygun bir modeldir. Bu çözünür maddeler Calu-3 hücrelerinde sitokin yanıtlarında önemli artışlara neden olan maddeler. Dizel egzoz ve DQ12 gibi çözünmeyen parçacıkları test etmek için bir kokültür modeline ihtiyaç vardır, çünkü makrofajlar parçacık maruziyeti ile etkilerin indüksiyonunda çok önemli bir rol oynar.

Açıklanan maruziyetler için 3.0 μm gözenekli kesici uç membranları kullanılmıştır. Bu tip kesici uçların seçilmesinin ana nedeni, nanomalzemelerin translokasyonunun test edilmesidir. Daha küçük 0,4 μm gözenek boyutu kullanırken, parçacık aglomeraları kesici uç zarını geçemez. Büyük bir gözenek boyutu kullanmanın dezavantajı, hücrelerin bir araya gelmek için daha uzun bir zamana ihtiyaç duyması ve hücrelerin morfolojisini ışık mikroskopisi kullanarak görselleştirmenin daha zor olmasıdır. Hücrelerin bir arada tek katman oluşturarak oluşturmadığını denetlemek için, teer pozlamayı başlatmadan önce >1.000 Ω x cm2 olmalıdır.

Birlikte ele alındığında, burada sunulan Calu-3 bronş modeli, en az 3 haftaya kadar aerosollere tekrar tekrar maruz kalmak için kullanıma uygundur. Model, sürekli bir hava akışı ile kültürlü ve maruz kalınmaya dayanabilir ve bronşiyal epitel toksisiteyi tespit edebilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma AB projesi PATROLS (Gerçekçi nanomalzeme tehlike aSsessment için Fizyolojik Bağlantılı Araçlar) ve Hollanda Sağlık, Refah ve Spor Bakanlığı (proje V/050012) tarafından finanse edilmektedir. Dr. Yvonne Staal ve Dr. Jan van Benthem’e makaleyi eleştirel bir şekilde inceledikleri için teşekkür ederiz.

Materials

0.01 M NaOH Sigma Aldrich S5881
0.1M (x10) PBS Gibco 14200-059
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) Sigma Aldrich D6883
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) Abcam ab141525
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific Inc. 15290
Automated exposure station Vitrocell
Cell proliferation reagent WST-1 Roche 11644807001
Centrifuge Eppendorf
CPC TSI inc., St Paul MN, USA 3022
Cytotoxicity detection kit LDH Roche 11644793001
DQ12 IOM nanomaterials
ELISA Ready-SET-Go Fischer Scientific 88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2 World Precision Instruments Inc., FL, USA EVOM2-STX2
FBS Greiner bio-one 758093
Flow splitter TSI inc., St Paul MN, USA model 3708
Fluorescein diacetate (F-DA) Sigma Aldrich F7378
HBSS Thermo Fisher Scientific Inc. 14175
Light microscope Olympus CKX41
Mass flow controllers MFC, Bronkhorst, the Netherlands
Methanol (analytical grade) Sigma Aldrich 34860
Microbalance Sartorius, Goettingen, Germany ME-5
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific Inc. 41090
NEAA Thermo Fisher Scientific Inc. 11140
OPS TSI inc., St Paul MN, USA 3339
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific Inc. 15140
Phenol red free MEM Gibco 10500-064
Pure water Merck MilliQ
SMPS TSI inc., St Paul MN, USA 3936
Spray nozzle Schlick, Coburg, Germany
Teflon filters Pall R2PJ46
TEOM Rupprecht & Patashnick NY, USA series 1400
Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific Inc. 690175, 658175, 660175
Transwell inserts Corning 3460, 3462
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific Inc. 25300
Tryptan Blue Sigma Aldrich T8154
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology. Nanomaterials (Basel). 7 (2), 49 (2017).
  2. Herzog, F., et al. Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches. The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).
  3. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  4. Paur, H. R., et al. In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology. Journal of Aerosol Science. 42 (10), 668-692 (2011).
  5. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations. Applied in vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  6. Loret, T., et al. Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 58 (2016).
  7. Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).
  8. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives in Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  9. Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport. PLoS One. 11 (10), 0165225 (2016).
  10. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  11. Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (1), 1-21 (2016).
  12. Jeong, M. H., et al. In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576 (2019).
  13. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmacology Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
  14. Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of Virological Methods. 174 (1-2), 144-149 (2011).
  15. . Vitrocell® Automated Exposure Station Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1 (2019)
  16. Mülhopt, S., et al. Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system. Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).
  17. . VITROCELL® Cloud for the exposure to liquid aerosols Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system (2019)
  18. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 40 (2014).
  19. Lenz, A. G., et al. Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (4), 526-535 (2014).
  20. Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism. Critical Reviews in Toxicology. 41 (9), 756-770 (2011).
  21. Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23 (2018).
  22. Kawasaki, H. A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity. Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).
  23. Sayes, C. M., et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles. Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).
  24. Driscoll, K. E., et al. Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide. Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).
  25. Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica. Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, 27-29 (1995).
  26. Peeters, P. M., et al. Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs. Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).
  27. Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats. Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).
  28. Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months. Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).
  29. Cho, W. S., et al. Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).
  30. Herzog, F., et al. Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11 (2013).
  31. Mülhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement. Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).
  32. van Ravenzwaay, B., et al. Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz. Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).
  33. Henderson, R. F., et al. A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats. Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).

Tags

Air-liquid InterfaceBronchial Epithelial CellsInhalation ExposureToxicity TestingTransepithelial Electrical ResistanceCell CultureAir-liquid Interface CultureAirborne Particles

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Braakhuis, H. M., He, R., Vandebriel, R. J., Gremmer, E. R., Zwart, E., Vermeulen, J. P., Fokkens, P., Boere, J., Gosens, I., Cassee, F. R. An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (159), e61210, doi:10.3791/61210 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image