iPS細胞由来腸オルガノイドの作製による発生・疾患モデリングへの応用

注:以下に詳述するすべての組織培養作業は、クラスII層流フードで行う必要があります。 1. ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の後腸内胚葉への分化 細胞培養フラスコに細胞外マトリックスをコーティングするには、まず必要なマトリックスの量を計算します。これは、マトリゲルでコーティングされた12ウェルプレートの例です。12ウェルプレートをコーティングするために必要な細胞外マトリックスの量を計算します。次の式を使用します。注:細胞培養皿に細胞外マトリックスをコーティングします。マトリゲルを使用する場合は、播種前の濃度0.035 mg/cm2 24時間で分化してください。製品シート上の細胞外マトリックスのバッチ濃度を確認し、メーカーの指示に従って実験の前に少量のアリコートを調製します。 p1000ピペットを使用して、必要な量の細胞外マトリックスを冷たいDMEM培地で希釈します。 5 mLのストリペットを使用してよく混合します。 500 μLの希釈マトリックスを各ウェルプレートに加えます。プレートを静かに振とうして希釈した細胞外マトリックスを均一に分散させ、37°Cで最低12時間インキュベートします。 細胞をプレートに播種する前に、各ウェルを500 μLのPBSで洗浄し、余分な細胞外マトリックスを除去します。これにより、分化中の細胞の剥離が防止されます。 細胞外マトリックスの乾燥を防ぐために、播種する準備ができるまで、最後の洗浄をウェルに残します。 ヒトiPS細胞を最終的内胚葉(DE)または後腸(HG)に分化させるには、選択した維持培地(例:必須8培地)で培養したiPS細胞のフラスコを採取し、培地を吸引します。(ここでは、25,000細胞/cm2で細胞を播種します)。注:播種密度は分化を成功させるために重要であり、個々のiPS細胞株ごとに最適化する必要があります。 フラスコ内の細胞を5 mLのPBSで洗浄します。PBSを吸引します。 2.5 mLの細胞解離溶液(TrypLEなど)を加え、室温で4分間放置します。細胞解離溶液を吸引し、フラスコを軽くたたいて細胞を剥離します。 37°Cに温めた5 mLのDMEM培地でフラスコを洗浄し、すべての細胞を15 mLのチューブに集めます。 再懸濁した細胞溶液10 μLを採取し、血球計算盤で細胞密度を測定します。 1.05 x 106 個の細胞を採取するのに十分な量の細胞懸濁液を採取し、15 mLチューブに入れます。 160 x g で3分間回転させます。細胞を遠心分離している間に、細胞外マトリックスでコーティングした12ウェルプレートからPBSを吸引します。 遠心分離後、上清を吸引し、ROCK阻害剤(10 μM)を含む12 mLの維持培地に細胞ペレットを再懸濁します。 p1000ピペットを使用して、12ウェルプレートの各ウェルに1 mLの細胞懸濁液を加えます。細胞ウェルを再懸濁して、ウェル間に均等に分布するようにします。 プレートを静かに振って、プレートのウェル内に細胞を分散させますが、ウェルの中央に細胞が濃縮されるため、培地の渦巻きを避けてください。 37°C、5%CO2 インキュベーターに入れます。 シード後24時間で培地をメンテナンス培地(エッセンシャル8培地など)のみ(ROCK阻害剤なし)に変更します。 DEへの分化を開始するには、 表1に従って内胚葉基礎培地を調製する。注:分化の開始時に、細胞は60〜80%のコンフルエントにある必要があります。 アクチビンA(100 ng/mL)およびWnt3(50 ng/mL)を内胚葉基底培地に添加して、12 mLのDE培地を調製します。 培地を37°Cにウォームアップします。 組織培養プレートまたはフラスコの各ウェルから培地を吸引する。 12ウェルプレートの各ウェルに1 mLのDE培地を添加して、DEの分化を開始します。 DE分化開始から24時間後(D1 DE)、新しいDE培地を調製し、培地交換を行います。 ステップ 1.24 を 48 時間(D2 DE)で繰り返します。この段階で細胞死が多く見られる場合は、培地交換前にすべてのウェルを500 μLのPBSで洗浄してください。注:内胚葉の分化が成功したことを確認するには、フローサイトメトリーを実施してSOX17の発現を評価します。通常、D3 DEまでに>80%の細胞がSOX17陽性になると予想されます。SOX17の発現が最適でない場合は、細胞播種密度とAct-Aの濃度を最適化する必要があります。 この時点でHG分化を開始します、つまりDE分化の開始から72時間後。CHIR99021(3 μM)およびRA(1 μM)を内胚葉基底培地に添加して、12 mLのHG培地を調製します(表1)。注:D3 DEでは、セルは均一な単層を形成しているはずです。最適なDE分化は、分化の次の段階にとって重要です。 DE培地を吸引します。 12ウェルプレートの各ウェルに1 mLのHG培地を添加して、HGの分化を開始します。 毎日の培地交換で4日間分化を続けます。注:DE事後処理の成功を判断するには、フローサイトメトリーを実施してCDX2の発現を評価します。HG分化のD4までに、通常、細胞の>80%がCDX2陽性であると予想されます。事後処理が最適でない場合は、CHIR99021の濃度を最適化する必要があります。 RNA抽出用のサンプルを採取するには、分化培地を吸引し、500μLのPBSでウェルを洗浄します。 PBSを吸引し、RNA抽出キットから適量の細胞溶解バッファーを添加します。 p1000ピペットを使用して、ウェルの底をこすり、すべての細胞が確実に溶解するようにします。 細胞ライセートを吸引し、清潔なチューブに入れます。 RNA抽出に進むか、RNA抽出の準備ができるまでライセートを-20°Cで凍結します。 免疫染色には、分化培地を吸引し、500 μLのPBSでウェルを洗浄します。 PBSを吸引し、500 μLの4% PFAを加えます。注:PFAは有毒です。適切なPPEを使用し、PFAの廃棄については地域の検査手順に従ってください。 4°Cで20分間インキュベートします。 PFAを除去し、500 μLのPBSでウェルを3回洗浄します。 免疫染色の準備が整うまで、細胞に最後のPBS洗浄を放置します。 2. 腸管オルガノイドの継代 表2に従って腸の基礎培地を調製する。 2D細胞培養から3D細胞培養に移行するには、6ウェルプレートを使用して、ヒトiPS細胞からDE細胞を作製します。5 mLのストリペットを使用して、6セルプレートを形成する細胞の単層を剥離します。 細胞を15 mLの遠心チューブに集めた後、400 x g で1分間遠心分離して細胞ペレットを作製します。 細胞ペレットを、成長因子を含む腸内増殖培地に再懸濁します:SB202190(10 μM)、A83-01(500 nM)、ガストリン(10 nM)、ノギン(100 ng/μL)、EGF(500 ng/μL)、R-Spondin1(100 ng/mL)、CHIR99021(6 μM)、ROCK阻害剤(10 μM)。 播種するウェルの数に応じて、適切な量の細胞外マトリックスを添加します。これは、以下の式を使用して計算できます。[1] 細胞外マトリックス/培地の総容量 (μL) = 30 μL * 48 ウェルプレートのウェル数[2] 細胞外マトリックスの必要量(μL)=[1]×2/3からの回答[3] 必要培地量(μL)=[1]からの回答 * 1/3 30 μLの細胞懸濁液を48ウェルプレートの各ウェルの中央に添加します。 プレートを37°Cのインキュベーターで最低5分間インキュベートし、細胞外マトリックスを固化させます。 細胞外マトリックスドームが固まったら、すべての成長因子を含む300 μLの腸内増殖培地を各ウェルに加えます。 プレートを 5% CO2 を含む 37 °C のインキュベーターに戻します。注:48時間後にオルガノイドが観察されない場合、および/または有意な細胞死がある場合は、ROCKiおよびNOGGIN濃度を最適化する必要があります。 オルガノイドを継代するには、光学顕微鏡で細胞を観察し、オルガノイドの密度とサイズを評価し、継代が必要かどうかを判断します。 細胞培養培地を氷冷PBSに置き換えてください。注:オルガノイド培養物は、約5〜7日ごとに分割する必要があります。腸管内腔内に明らかな細胞破片の蓄積と周囲の腸内増殖培地の黄変がある場合は、腸管内培養物の継代が必要です。 オルガノイドと細胞外マトリックス球体を、5 mLのストリペットで掻き取る動作でプレートから機械的に剥離します。 オルガノイドを各ウェルから15 mLの遠心チューブに集めます。 オルガノイド懸濁液を400 x g で1分間遠心分離し、オルガノイドをペレット化します。細胞ペレットの頂上に達するまで上清を吸引し、目に見える細胞外マトリックス層に到達したら注意する。 ペレットを氷冷したPBS15 mLに再懸濁します。注:このステップは、最初のスピンで除去されなかった残りの細胞外マトリックスを洗浄するのに役立ちます。 400 x g で1分間遠心分離します。オルガノイドを含むペレットまで培地を吸引します。 氷冷したPBS1 mLに再懸濁します。p200ピペットを使用して、ピペッティングを数回行うことで、インタクトオルガノイドを手動で破壊します。注:光学顕微鏡を使用してオルガノイドのサイズを観察し、さらに解離する必要があるかどうかを判断します。 成長因子を含まない培地9 mLを添加します。 400 x g で1分間遠心分離します。オルガノイドペレットになるまで上清を吸引します。 以下の式を使用して、必要な細胞外マトリックスと培地の量を計算します。[1] 細胞外マトリックス/培地の総容量 (μL) = 30 μL * 48 ウェルプレートのウェル数[2] 細胞外マトリックスの必要量(μL)=[1]×2/3からの回答[3] 必要培地量(μL)=[1]からの回答 * 1/3 オルガノイドペレットを、成長因子(NogginおよびROCK阻害剤を含む)を含む計算された量の腸内培地に再懸濁します。 この細胞懸濁液に必要量の細胞外マトリックスを添加し、オルガノイドが均一に分布するように再懸濁します。 この懸濁液30μLを48ウェルプレートの各ウェルの中央にピペットで移します(できれば37°Cのインキュベーターで予熱します)。 細胞外マトリックスが固まるまで、プレートを37°Cのインキュベーターに5分間戻します。 成長因子(+ ROCK阻害剤)を含む腸内培地を調製します(48ウェルプレートあたり約17 mL)。 各ウェルに300μLを添加します。 37°C、5% CO2でインキュベートします。 継代後、腸オルガノイドの培地を吸引し、2〜4日ごとに成長因子(NogginおよびROCK阻害剤なし)を含む新鮮な腸培地と交換します。注:48時間後にオルガノイドが観察されない場合、および/または有意な細胞死がある場合は、ROCKiおよびNOGGIN濃度を最適化する必要があります。注:腸オルガノイドは、in vivoでさまざまな炎症性メディエーターに反応します。TNFαは、いくつかの炎症過程に関与する細胞シグナル伝達タンパク質です。 腸オルガノイドで炎症反応を引き起こすには、基礎培地のみで40 ng/mLの濃度でTNFαを調製します。 48ウェルプレートから培地を吸引します。 40 ng/mL の TNFα を含む調製した基礎培地 300 μL を添加します。 プレートを37°Cで48時間インキュベートし、炎症誘発性環境を再現します。注:腸オルガノイドは、in vivoでさまざまな炎症性メディエーターに反応します。TNFαは、いくつかの炎症過程に関与する細胞シグナル伝達タンパク質です。 残った細胞は、5%トリジーンを含む真空トラップに吸引して廃棄します。