יצירת אורגנואידי מעיים שמקורם ב-hiPSC עבור יישומים התפתחותיים ומידול מחלות

הערה: כל עבודת תרבית הרקמה המפורטת להלן צריכה להיעשות במכסה מנוע זרימה למינרית Class II. 1. התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) לאנדודרם המעי האחורי כדי לצפות בקבוק תרבית תאים במטריצה חוץ-תאית, חשב תחילה את כמות המטריצה הדרושה. הנה דוגמה של צלחת 12 בארות להיות מצופה Matrigel. חשב את הכמות הנדרשת של מטריצה חוץ-תאית כדי לצפות צלחת 12 באר. השתמש בנוסחה הבאה:הערה: צפו צלחות תרבית תאים במטריצה חוץ-תאית לבחירה. אם אתם משתמשים במטריג’ל, יש להשתמש בריכוז של 0.035 מ”ג/ס”מ2 24 שעות לפני הזריעה לצורך בידול. בדוק את ריכוז האצווה של מטריצה חוץ-תאית בדף המוצר והכן אליציטוטים קטנים יותר לפני ניסויים בהתאם להוראות היצרן. לדלל את הכמות הנדרשת של מטריצה חוץ-תאית במדיה DMEM קרה באמצעות פיפטה p1000. מערבבים היטב באמצעות סטריפט 5 מ”ל. הוסף 500μL של מטריצה מדוללת לכל צלחת באר. נערו את הצלחת בעדינות כדי לפזר באופן שווה את המטריצה החוץ תאית המדוללת ולדגור במשך 12 שעות לפחות ב-37°C. לפני זריעת תאים לצלחת, לשטוף כל באר עם 500 μL של PBS כדי להסיר מטריצה חוץ-תאית עודפת. זה ימנע ניתוק תאים במהלך ההתמיינות. השאירו את השטיפה האחרונה בבארות עד שהיא מוכנה לזרע כדי למנוע התייבשות של מטריצה חוץ-תאית. כדי לזרוע התמיינות של hiPSCs לכיוון אנדודרם סופי (DE) או מעיים אחוריים (HG), קחו בקבוק של hiPSCs שגודלו בתרבית באמצעי תחזוקה לפי בחירה (למשל: מדיה חיונית 8) ושאפו את המדיה. (כאן, אנו זורעים תאים ב 25,000 תאים לסמ”ק2).הערה: צפיפות הזריעה חיונית להתמיינות מוצלחת ויש למטב אותה עבור כל קו תאי hiPSC בנפרד. לשטוף את התאים בבקבוק עם 5 מ”ל של PBS. שאפו את PBS. הוסף 2.5 מ”ל של תמיסת דיסוציאציה של תאים (למשל, TrypLE) והשאר ב- RT למשך 4 דקות. שאפו את תמיסת הדיסוציאציה התאית וטפחו על הבקבוק בעדינות כדי לנתק את התאים. לשטוף את הבקבוק עם 5 מ”ל של מדיה DMEM מחומם ל 37 ° C ולאסוף את כל התאים לתוך צינור 15 מ”ל. קח 10 μL של תמיסת תא מרחף ולמדוד את צפיפות התא עם המוציטומטר. קח מספיק של תרחיף התא כדי לאסוף 1.05 x 106 תאים ומניחים בצינור 15 מ”ל. סבבו במהירות של 160 x גרם במשך 3 דקות. בזמן שהתאים עוברים צנטריפוגה, שאפו PBS מהמטריצה החוץ תאית המצופה 12 בארות. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוף את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-12 מ”ל של אמצעי תחזוקה עם מעכב ROCK (10 מיקרומטר). באמצעות פיפטה p1000, להוסיף 1 מ”ל של תרחיף התא לכל באר של צלחת 12 באר. להשהות מחדש את התאים היטב כדי להבטיח חלוקה שווה בין הבארות. נערו את הצלחת בעדינות כדי לפזר את התאים בתוך בארות הצלחת אך הימנעו מערבולות של המדיה מכיוון שהיא תרכז את התאים במרכז הבארות. מניחים באינקובטור 37°C, 5% CO2 . שינוי מדיה למדיית תחזוקה (למשל, מדיה חיונית 8) בלבד (ללא מעכב ROCK) 24 שעות לאחר הזריעה. כדי להתחיל בהתמיינות ל-DE, הכינו את המדיה הבסיסית של אנדודרם לפי טבלה 1.הערה: בתחילת ההתמיינות התאים צריכים להיות במפגש של 60-80%. הכן 12 מ”ל של מדיה DE על ידי הוספת Activin A (100 ng/mL) ו- Wnt3 (50 ng/mL) למדיה הבסיסית של האנדודרם . חממו את המדיה ל-37°C. שאפו מדיה מכל באר של צלחת תרבית הרקמה או הצלוחית. התחל את בידול DE על ידי הוספת 1 מ”ל של מדיה DE לכל באר של צלחת 12 באר. ב-24 שעות לאחר התחלת בידול DE (D1 DE), הכינו מדיית DE טרייה ובצעו שינוי מדיה. חזור על שלב 1.24 ב- 48 שעות (D2 DE). אם הרבה מוות תאי קיים בשלב זה, לשטוף את כל הבארות עם 500 μL של PBS לפני שינוי התקשורת.הערה: כדי לאשר התמיינות אנדודרם מוצלחת, בצע ציטומטריית זרימה כדי להעריך ביטוי של SOX17. בדרך כלל אנו מצפים >80% מהתאים להיות SOX17 חיובי על ידי D3 DE. אם הביטוי של SOX17 הוא תת-אופטימלי, צפיפות זריעת התאים צריכה להיות אופטימלית, כמו גם ריכוזים של Act-A. התחל התמיינות HG בנקודה זו, כלומר 72 שעות לאחר תחילת התמיינות DE. הכן 12 מ”ל של מדיה HG על-ידי הוספת CHIR99021 (3 מיקרומטר) ו- RA (1 מיקרומטר) למדיה הבסיסית של אנדודרם (טבלה 1).הערה: ב-D3 DE התא היה צריך ליצור חד-שכבה אחידה. בידול DE אופטימלי הוא קריטי לשלבים נוספים של בידול. לשאוף DE מדיה. התחל בידול HG על ידי הוספת 1 מ”ל של מדיה HG לכל באר של צלחת 12 באר. המשך את הבידול במשך 4 ימים עם שינויי מדיה יומיים.הערה: כדי לקבוע הצלחה של פוסטריוריזציה של DE, בצע ציטומטריית זרימה כדי להעריך ביטוי של CDX2. על ידי D4 של התמיינות HG אנו מצפים בדרך כלל >80% מהתאים להיות CDX2 חיובי. אם הפוסטריוריזציה אינה אופטימלית, ריכוז CHIR99021 צריך להיות אופטימלי. כדי לאסוף דגימה למיצוי RNA, שאפו אמצעי התמיינות ושטפו את הבאר עם 500 ul של PBS. שאפו PBS והוסיפו נפח מתאים של חיץ ליזה תאי מערכת מיצוי RNA. באמצעות פיפטה p1000, לגרד את החלק התחתון של הבאר כדי להבטיח ליזה של כל התאים. שואפים את התא ליזט ומניחים בצינור נקי. המשך למיצוי RNA או הקפיא את הליזט ב -20 ° C עד מוכן למיצוי RNA. עבור immunostaining, לשאוף הבחנה מדיה לשטוף בארות עם 500 μL של PBS. שאפו את PBS והוסיפו 500 μL של 4% PFA.הערה: PFA רעיל. השתמש בציוד הגנה אישי מתאים ופעל לפי נהלי מעבדה מקומיים לסילוק PFA. יש לדגור ב-4°C למשך 20 דקות. הסר PFA ולשטוף את הבארות עם 500 μL של PBS שלוש פעמים. השאירו את שטיפת PBS האחרונה על התאים עד מוכנים לביצוע immunostaining. 2. מעבר של אורגנואידים במעיים הכינו את מצע הבסיס של המעי לפי טבלה 2. כדי לעבור מתרבית תאים דו-ממדית לתלת-ממדית, השתמש בלוח 6 בארות כדי ליצור תאי DE בצורת hiPSCS. נתקו את שכבת התאים החד-שכבתית ויוצרים את צלחת 6 התאים באמצעות פסים של 5 מ”ל. לאסוף תאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ”ל, לפני צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 1 דקה כדי לייצר גלולה התא. יש להשהות מחדש את כדורית התא במצע גדילה של המעי המכיל גורמי גדילה: SB202190 (10 מיקרומטר), A83-01 (500 ננומטר), גסטרין (10 ננומטר), נוגין (100 ננוגרם/מיקרוליטר), EGF (500 ננוגרם/מיקרוליטר), R-ספונדין1 (100 ננוגרם/מ”ל), CHIR99021 (6 מיקרומטר), מעכב רוק (10 מיקרומטר). הוסף נפח מתאים של מטריצה חוץ-תאית בהתאם למספר הבארות המצופות לתוכן. ניתן לחשב זאת באמצעות המשוואות שלהלן.[1] נפח כולל של מטריצה/מדיה חוץ-תאית (μL) = 30 μL * מספר הבארות של צלחת 48 בארות[2] נפח נדרש של מטריצה חוץ-תאית (μL) = מענה מאת [1] * 2/3[3] נפח מדיה נדרש (μL) = מענה מאת [1] * 1/3 הוסף 30 μL של תרחיף תאים למרכז כל באר של צלחת 48 באר. דוגרים על הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות כדי לאפשר למטריצה החוץ תאית להתמקם. לאחר שכיפות המטריקס החוץ תאיות שקעו, הוסיפו 300 μL של מצע גדילה במעיים המכיל את כל גורמי הגדילה לכל באר. מחזירים את הצלחת לאינקובטור של 37°C עם 5% CO2.הערה: אם לאחר 48 שעות לא ניתן לראות אורגנואידים ו / או יש מוות תאי משמעותי, ייתכן שיהיה צורך למטב את ריכוזי ROCKi ו- NOGGIN. כדי לעבור את האורגנואידים, התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ אור כדי להעריך את צפיפות וגודל האורגנואידים ולקבוע אם הם זקוקים למעבר. החלף מדיה של תרבית תאים ב- PBS קר כקרח.הערה: תרביות אורגנואידים יצטרכו להתפצל בערך כל 5-7 ימים. מעבר של תרביות אורגנואידים במעי נדרש ברגע שיש הצטברות של פסולת תאים ניכרת בתוך לומן אורגנואיד והצהבה של מצהיב של מצע הגידול במעי שמסביב. נתק באופן מכני אורגנואידים וכדור מטריצה חוץ-תאי מהצלחת באמצעות תנועת גירוד עם פס 5 מ”ל. אספו את האורגנואידים מכל באר לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ”ל. תרחיף אורגנואיד צנטריפוגה ב 400 x גרם למשך דקה אחת כדי לגלול את האורגנואידים. שאפו את הסופרנאטנט עד שיגיעו לחלק העליון של גלולת התא, תוך זהירות כאשר הגיעו לשכבת המטריצה החוץ-תאית הנראית לעין. להשעות את הגלולה ב 15 מ”ל של PBS קר כקרח.הערה: שלב זה משמש לשטיפת כל מטריצה חוץ-תאית שנותרה שלא הוסרה בסחרור הראשוני. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 1 דקה. שואפים את התקשורת עד הכדור, המכיל את האורגנואידים. Resuspend ב 1 מ”ל של PBS קר כקרח. באמצעות פיפטה p200, לשבש ידנית את האורגנואידים השלמים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה מספר פעמים.הערה: התבונן בגודל האורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לקבוע אם יש צורך בניתוק נוסף. הוסף 9 מ”ל של מדיה ללא גורמי צמיחה. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 1 דקה. שואפים את הסופרנאטנט עד לכדור האורגנואידים. חשב את הכמות הנדרשת של מטריצה חוץ-תאית ומדיה באמצעות המשוואות הבאות:[1] נפח כולל של מטריצה/מדיה חוץ-תאית (μL) = 30 μL * מספר הבארות של צלחת 48 בארות[2] נפח נדרש של מטריצה חוץ-תאית (μL) = מענה מאת [1] * 2/3[3] נפח מדיה נדרש (μL) = מענה מאת [1] * 1/3 יש להשהות מחדש את כדורית האורגנואיד בנפח המחושב של מצע המעי עם גורמי גדילה (כולל מעכב Noggin & ROCK). הוסף את הנפח הנדרש של מטריצה חוץ-תאית לתרחיף תא זה והשהה מחדש כדי להבטיח פיזור אחיד של אורגנואידים. פיפטה 30 μL של השעיה זו למרכז כל באר של צלחת 48 באר (רצוי מחומם מראש באינקובטור 37 מעלות צלזיוס). מחזירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות עד שהמטריצה החוץ תאית שוקעת. הכן מדיה מעיים עם גורמי גדילה (+ מעכב ROCK) (כ 17 מ”ל לכל צלחת 48 באר). הוסיפו 300 μL לכל באר. יש לדגור ב-37°C ב-5% CO2. לאחר המעבר, יש לשאוף את המצע לאורגנואידים במעי ולהחליף במצע מעי טרי בגורמי גדילה (ללא מעכב Noggin & ROCK) כל 2-4 ימים.הערה: אם לאחר 48 שעות לא ניתן לראות אורגנואידים ו / או יש מוות תאי משמעותי, ייתכן שיהיה צורך למטב את ריכוזי ROCKi ו- NOGGIN.הערה: אורגנואידים במעיים מגיבים למגוון מתווכי דלקת in vivo. TNFα הוא חלבון איתות תאי המעורב במספר תהליכים דלקתיים. כדי לעורר תגובה דלקתית באורגנואידים במעי, יש להכין TNFα בריכוז של 40 ננוגרם/מ”ל במצע הבסיסי בלבד. לשאוף מדיה מ 48 צלחת באר. הוסף 300 μL של מדיה בסיסית מוכנה המכילה 40 ng/mL TNFα. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C למשך 48 שעות כדי לשכפל סביבה פרו-דלקתית.הערה: אורגנואידים במעיים מגיבים למגוון מתווכי דלקת in vivo. TNFα הוא חלבון איתות תאי המעורב במספר תהליכים דלקתיים. יש להיפטר מכל התאים הנותרים על ידי שאיפה למלכודת ואקום המכילה 5% טריגן.