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Neuroscience

回転加速度に基づくラットにおけるびまん軸索脳損傷の誘導

Published: May 09, 2020
doi:
10.3791/61198
, , , , , , , , ,
1Division of Anesthesia and Critical Care, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences,Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences,Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Anesthesiology,Yale University School of Medicine, 4Recanati School for Community Health Professions, Faculty of Health Sciences,Ben-Gurion University of the Negev, 5Department of microbiology and immunology, Faculty of Health Sciences,Ben-Gurion University of the Negev

Summary

このプロトコルは、頭蓋骨骨折や挫傷なしに広範囲にわたる白質損傷を誘発する脳びまん軸索損傷(DAI)の信頼性の高い、実行しやすく、再現可能なげっ歯類モデルを検証する。

Abstract

外傷性脳損傷(TBI)は、死亡および障害の主な原因である。びまん軸索損傷(DAI)は、入院を必要とするTBI患者の大部分において傷害の主要なメカニズムである。DAIは、揺れ、回転、または爆風による広範囲にわたる軸索損傷を伴い、急速な軸索ストレッチ損傷および機能回復への長期的な影響に関連する二次軸索変化を引き起こした。歴史的に、焦点損傷のないDAIの実験モデルは設計が困難であった。ここでは、頭蓋骨骨折や挫傷なしに広範囲にわたる白質損傷を引き起こすDAIのシンプルで再現可能で信頼性の高いげっ歯類モデルを検証します。

Introduction

外傷性脳損傷(TBI)は、米国における死亡および障害の主な原因である。TIは、全傷害関連死の約30%に寄与する11,2.2TBIの主な原因は、年齢層によって異なり、転倒、スポーツ中の高速衝突、意図的な自傷行為、自動車の衝突および暴行11、2、32,3が含まれます。

脳拡散軸索損傷(DAI)は、傷害後の瞬間における無制限の頭部の動きから生じる回転加速度、揺れまたは発爆傷害によって誘発される特定のタイプのTBIである44、5、6、7、8。5,6,7,8DAIは、結果の悪さ、負担の大きい医療費、および,33-64%の死亡率,,,1、2、4、5、9、10、112に関連1する長期的な神経障害につながる広範囲にわたる軸索損傷10を伴う。459DAIの病因に関する重要な最近の研究にもかかわらず、最良の治療オプション11、12、13、14,13,14についてのコンセンサスはありませんでした。11,

過去数十年にわたり、多数の,実験モデルがDAI 11、12、15、16のさまざまな側面を正確に複製しようとしました。11,12,1516しかし、これらのモデルには、他の焦点損傷と比較してDAIのユニークな提示を与えられた制限があります。これらの以前のモデルは、白質領域で軸索損傷を引き起こすだけでなく、焦点脳損傷をもたらす。臨床的には、DAIは微小出血を伴い、白質の損傷の主な原因となる可能性がある。

DAIの主要な臨床特徴を再現する動物モデルは2つだけ示されている。Gennarelliたちは、1982年に第1の横方向頭回転装置を製造し、非ヒト霊長類モデル15においてDAIを用いて昏睡を誘導するために、無衝撃頭部回転加速度を用いた。この霊長類モデルは、加速と減速のために制御された単一回転を採用し、10〜20ミリ秒以内に60°を通して頭を置き換えました。しかし、霊長類モデルは非常に高価な4,4、11、16,16です。前のモデルの一部に基づいて、回転加速度脳損傷の豚モデルは、同様の結果を持つ1994年(Rossら14)で設計された。

これら2つの動物モデルは、典型的な病理の異なるプレゼンテーションを生み出したものの、DAIの病態の概念に大きく加えた。急速な頭部の回転は一般にDAIを誘発するための最良の方法として受け入れられ、げっ歯類は急速な頭部回転の研究11、16,16のためのより安価なモデルを提供する。ここでは、頭蓋骨骨折や挫傷のない広範囲にわたる白質損傷を引き起こすDAIのシンプルで再現可能で信頼性の高いげっ歯類モデルを検証します。このモデルは、DAIの病態生理学の理解と、より効果的な治療法の開発を可能にします。

Protocol

実験は、ヘルシンキと東京宣言の勧告と欧州共同体の実験動物の使用に関するガイドラインに従って行われた。実験は、ネゲブのベングリオン大学の動物ケア委員会によって承認されました. 実験手順のための1.ラットの準備 注:300〜350グラムの体重の成人オススプレイグドーリーラットを選択してください。 これらの実験の承認を、施設動物…

Representative Results

表 1 は、プロトコルのタイムラインを示しています。DAIのこのモデルの死亡率は0%であった。マン・ホイットニーの検定では、介入後48時間(Mdn = 1対0)、U=22.5、p<0.001、r=0.78(表2参照)に比べて15匹のDAIラットに対して神経学的欠損が有意に大きいことが示された。データはカウントで測定され、中央値と 25 ~ 75 パーセンタイル範囲として表示されます。 <p class="jove_conte…

Discussion

このプロトコルはDAIのげっ歯類モデルを記述する。DAIでは、脳の回転加速は、進行過程で軸索機能の喪失につながる軸索および生化学的変化を引き起こすせん断効果を引き起こす。二次軸索の変化は、急速な軸索ストレッチ傷害によって生成され、その程度および重症度44、5、105,10で可変である。一次損傷後数日以内に、…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ネイサン・クレーオリン博士(ネゲブのベングリオン大学機械工学科)が生体機械測定を支援してくれたことに感謝している。また、オレナ・スヴィノフスカ教授、マリナ・クシェリアワ教授、マクシム・クリヴォノソフ、ダリーナ・ヤクメンコ、エフゲニア・ゴンチャリク生物学・生態学・医学部、オレス・ホンチャー・ドニプロ大学、ドニプロ、ウクライナの支援と貢献に感謝します。

Materials

0.01 M sodium citrate SIGMA – ALDRICH
2.5% normal horse serum SIGMA – ALDRICH H0146 Liquid
4 % buffered formaldehyde solution
Anti-Amyloid Precursor Protein, C – terminal antibodyproduced in rabbit SIGMA – ALDRICH Lot 056M4867V
biotinylated secondary antibody Vector BA-1000-1.5 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin
bone-cutting forceps
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine vector laboratory
embedding cassettes
ethanol 99.9 % ROMICAL Flammable Liquid
guillotine
Hematoxylin SIGMA – ALDRICH H3136-25G
Hydrogen peroxide solution Millipore 88597-100ML-F
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc
Olympus BX 40 microscope Olympus
paraffine paraplast plus leica biosystem Tissue embedding medium
phosphate-buffered saline (PBS) SIGMA – ALDRICH P5368-10PAK Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl – 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C.
Streptavidin HRP ABCAM ab64269 Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry.
xylene
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References

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Frank, D., Melamed, I., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Kuts, R., Shvartsur, R., Azab, A. N., Assadi, M. H., Vinokur, M., Boyko, M. Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration. J. Vis. Exp. (159), e61198, doi:10.3791/61198 (2020).
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