Идентификация и характеристика иммуногенных видов РНК в АЛЛЕРГЕНах HDM, которые модулируют воспаление эозинофилических легких
Summary
Экологические аллергены, такие как клещи домашней пыли (HDM) часто содержат микробные вещества, которые активируют врожденные иммунные реакции для регулирования аллергического воспаления. Представленный здесь протокол демонстрирует идентификацию видов дстрНК в аллергенах HDM и характеристику их иммуногенной деятельности при модуляции эозинофильного воспаления легких.
Abstract
Экологические аллергены, такие как клещи домашней пыли (HDM) часто находятся в сложных формах, содержащих как аллергические белки, которые приводят аномальные реакции типа 2 и микробных веществ, которые вызывают врожденные иммунные реакции. Эти аллерген-ассоциированные микробные компоненты играют важную роль в регулировании развития типа 2 воспалительных заболеваний, таких как аллергическая астма. Однако основополагающие механизмы остаются в значительной степени неопределенными. Представленный здесь протокол определяет структурные характеристики и активность аллерген-ассоциированной иммуностимуляторной РНК. В частности, общие аллергены рассматриваются на наличие двухцепочечная РНК (dsRNA) видов, которые могут стимулировать ответы ИФН в легких и сдерживать развитие тяжелой эозинофилии легких в мышиной модели Индуцированной ХДС аллергической астмы. Здесь мы включили следующие три анализа: Dot пятно, чтобы показать структуры DSRNA в общей РНК, изолированные от аллергенов, включая вид HDM, RT-qPCR для измерения деятельности HDM РНК в интерферон стимулирующих генов (ISGs) выражение в легких мыши и анализ FACS для определения влияния HDM РНК на количество эозинофилов в BAL и легких, соответственно.
Introduction
Основываясь на гипотезе гигиены, первоначально предложенной Strachan1, раннее воздействие детей на экологические микробные факторы, такие как эндотоксин может защитить от развития аллергических расстройств2,3. Во время микробных инфекций, например, вирусных инфекций, врожденное иммунное обнаружение иностранных нуклеиновых кислот (РНК/ДНК) вызывает у хозяина защитные реакции4,,5,,6. Однако существование и распространенность иммуногенных нуклеиновых кислот, таких как длинные двуцепоченные РНК (dsRNA) видов в клещах домашней пыли (HDM) или других аллергенов насекомых остаются неизвестными. Этот протокол был разработан, чтобы определить, содержит ли HDM или аллергенов насекомых и неразвимов длинную дстрянк, которые могут активировать защитный иммунный ответ, чтобы противодействовать развитию тяжелого эозинофильного воспаления легких в мышиной модели аллергической астмы. Здесь мы предоставляем три простых и быстрых метода для оценки структурных детерминантов в общей РНК HDM, которые необходимы для регулирования аллергена индуцированного эозинофильного воспаления легких.
Слизистая иммунная система является крупнейшим иммунным органом в организме и служит первой линией защиты хозяина от микробных инфекций и аллергических оскорблений7,,8. Длинная dsRNA, репликация промежуточных многих вирусов, как известно, функционировать как патоген-ассоциированных молекулярной картины (PAMP), чтобы мощно стимулировать врожденные реакции через Toll как рецептор 3 (TLR3), чтобы вызвать выражение интерферона стимулировали гены (ISGs)9,10,11,12,13,14., Недавно мы показали, что HDM общей РНК содержит dsRNA структур, которые upregulated выражение ISGs и снижение тяжелой эозинофильных воспаление легких при введении через интракачельной привиливания в мурин модель аллергической астмы индуцированных HDM экстракты15. Тяжесть воспаления легких определяется путем анализа типов иммунных клеток в бронхоалвой лаваге (BAL) и легочной ткани через цитометрию потока16,,17,,18,19,20.
Этот протокол включает в себя три анализа: 1) быстрое обнаружение структур dsRNA с РНК точка пятно с помощью мыши моноклонального антитела J2, который специально связывается с dsRNA (40bp) в последовательности независимой манере; 2) быстрая оценка in vivo эффектов иммуностимуляторной РНК в легких мыши путем измерения индукции ISGs с помощью РТ-qPCR; 3) точная количественная количественная оценка эозинофилов в BAL и легких в контексте воспаления легких, вызванного HDM, с помощью анализа цитометрии потока.
Вышеупомянутые анализы могут быть использованы для изучения не только аллергических заболеваний легких, но и респираторных бактериальных и вирусных инфекций. Например, dsRNA специфические антитела J2 также могут быть использованы в других приложениях, таких как хроматография иммуноафизменности, иммуногистохимия, фермент-связанный иммуносорбент анализ (ELISA) и иммуносументирование21,22,23. Кроме того, несколько приложений вниз по течению сбора жидкости BAL могут быть использованы для количественной оценки растворимого содержимого, таких как цитокины и хемокины с использованием ELISA, и транскрипционное профилирование клеток в дыхательных путях (например, альвеолярные макрофаги). Хотя Есть целый ряд протоколов, доступных в литературе для оценки состояния легких, большинство из этих протоколов часто сосредоточены на целевой проверки. Описанные здесь процедуры могут быть применены для выявления компонентов экологических аллергенов, которые важны для регулирования развития аллергических заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Текущий протокол описывает, как оценить иммуностимуляторные свойства аллерген-ассоциированной микробной РНК и их влияние на развитие эозинофильного воспаления легких в мышиной модели аллергической астмы. Хотя длинные dsRNAs известны как репликации промежуточных многих вирусов, которы…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-жу Карлу Горену за техническую помощь в цитометрии потока. L.S. поддерживается Китайским советом стипендий и Провинциальным инновационным фондом провинции Хунань для аспирантов (CX201713068). H.H.A. поддерживается кафедрой клинических лабораторных наук, Колледжем прикладных медицинских наук, Университетом Джуфа, Сакака, Саудовская Аравия. X.D.L. поддерживается UT здравоохранения Сан-Антонио школа медицины стартап-фонд и Макс и Минней Voelcker фонда.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O’Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- . Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018)
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
