Identificação e Caracterização de Espécies imunogênicas de RNA em Alérgenos HDM que modulam inflamação pulmonar eosinofílica

Com base na hipótese de higiene originalmente proposta por Strachan¹, a exposição infantil a fatores microbianos ambientais, como a endotoxina, pode proteger contra o desenvolvimento de transtornos alérgicos^2,,3. Durante infecções microbianas, por exemplo, infecções virais, a detecção imune inata de ácidos nucleicos estranhos (RNA/DNA) desencadeia respostas de defesa do hospedeiro^4,,5,,6. No entanto, a existência e prevalência de ácidos nucleicos imunogênicos, como espécies de RNA (dsRNA) de dupla-encalhadas em ácaros domésticos (HDM) ou outros alérgenos de insetos permanecem desconhecidas. Este protocolo foi projetado para determinar se os alérgenos hdm ou insetos e não-insetos contêm espécies de dsRNA longas que podem ativar uma resposta imune protetora para neutralizar o desenvolvimento de inflamação pulmonar eosinofílica grave em um modelo de camundongo de asma alérgica. Aqui, fornecemos três métodos simples e rápidos para avaliar os determinantes estruturais no RNA total HDM que são necessários para regular a inflamação pulmonar eosinofílica induzida por alérgenos.

O sistema imunológico mucosa é o maior órgão imunológico do corpo e serve como primeira linha de defesa hospedeira contra infecções microbianas e insultos alérgicos^7,,8. O dsRNA longo, o intermediário de replicação de muitos vírus, é conhecido por funcionar como um padrão molecular associado ao patógeno (PAMP) para estimular potentemente respostas inatas via Toll like receptor 3 (TLR3) para induzir a expressão de genes estimulados por interferon (ISGs)^{9,,10,,11,12,13,14}. Recentemente, mostramos que o RNA total hdm continha estruturas de dsRNA, o que regulava a expressão dos ISGs e reduzia a inflamação pulmonar eosinofílica grave quando administrado através da instilação intratraqueal em um modelo murino de asma alérgica induzida pelos extratos de HDM¹⁵. A gravidade das inflamações pulmonares é determinada pela análise dos tipos de células imunes na lavagem broncoalveolar (BAL) e no tecido pulmonar através da citometria de fluxo^{16,17,,18,,19,20}.

Este protocolo inclui três ensaios: 1) detecção rápida de estruturas dsRNA com mancha de ponto RNA usando um anticorpo monoclonal de rato J2 que se liga especificamente ao dsRNA (≥40bp) de forma independente de sequência; 2) avaliação rápida para efeitos in vivo do RNA imunoestimulativo nos pulmões do camundongo medindo a indução de ISGs utilizando RT-qPCR; 3) quantificação precisa de eosinófilos em BAL e pulmão no contexto de inflamação pulmonar induzida pelo HDM utilizando a análise da citometria de fluxo.

Os ensaios acima podem ser usados para estudar não apenas doenças pulmonares alérgicas, mas também infecções bacterianas e virais respiratórias. Por exemplo, o anticorpo J2 específico dsRNA também pode ser usado em outras aplicações como cromatografia imunoaffinity, imunohistoquímica, ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) e imunostaining^21,,22,23. Além disso, várias aplicações a jusante da coleta de fluidos BAL podem ser utilizadas para quantificar conteúdos solúveis, como citocinas e quimiocinas usando ELISA, e perfil transcricional de células nas vias aéreas (por exemplo, macrófagos alveolares). Embora existam uma variedade de protocolos disponíveis na literatura para avaliar as condições pulmonares, a maioria desses protocolos muitas vezes se concentra na validação do alvo. Os procedimentos aqui descritos podem ser aplicados para identificar componentes em alérgenos ambientais que são importantes para regular o desenvolvimento de doenças alérgicas.