זיהוי ואפיון של מינים החיסוני של RNA ב-HDM אלרגנים לווסת דלקת ריאות אאוזינופילית
Summary
אלרגנים סביבתיים כגון קרדית אבק הבית (HDM) מכילים לעתים קרובות חומרים מיקרוביאלית המפעילים תגובות החיסונית מולדים לווסת דלקת אלרגית. הפרוטוקול המוצג כאן ממחיש את הזיהוי של מינים dsRNA ב אלרגנים HDM ואפיון של הפעילות החיסונית שלהם בדלקת ריאות אאוזינופילית.
Abstract
אלרגנים סביבתיים כגון קרדית אבק הבית (HDM) הם לעתים קרובות בצורות מורכבות המכילות גם חלבונים אלרגיים כי כונן מסוג שני תגובות וחומרים מיקרוביאלית לגרום לתגובות החיסונית מולדים. הרכיבים הקשורים לאלרגן בתחום החיידקים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות ההתפתחות של מצבים דלקתיים מסוג 2 כגון אסתמה אלרגית. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים נשארים בלתי מוגדרים ברובו. הפרוטוקול המוצג כאן קובע את המאפיינים המבבניים ובפעילות vivo של האלרגן הקשורים חיסוני מגירוי RNA. במיוחד, אלרגנים נפוצות נבדקים לנוכחות של כפול תקוע RNA (dsRNA) מינים שיכולים לעורר תגובות IFN בריאות ולרסן את ההתפתחות של הריאה הקשה אאוזינווליה במודל העכבר של אסטמה מושרה HDM. הנה, כללנו את שלושת: המילים הבאות שאומרות נקודה חשופה להראות את מבנים dsRNA בסך הכל RNA מבודדים אלרגנים כולל מינים HDM, RT-qPCR כדי למדוד את הפעילויות של ה-RNA HDM ב אינטרפרון מגרה גנים (ISGs) הביטוי בריאות העכבר ניתוח FACS כדי לקבוע את ההשפעות של ה-RNA HDM על מספר אאוזינופילים באל, בהתאמה
Introduction
מבוסס על השערת היגיינה המוצע במקור על ידי strachan1, החשיפה המוקדמת לגיל הסביבה גורמים מיקרוביאלית כגון אנדוטוקסין יכול להגן מפני פיתוח של הפרעות אלרגיות2,3. במהלך זיהומים מיקרוביאלית, למשל, זיהומים ויראליים, זיהוי החיסונית מולדת של חומצות גרעין זרות (RNA/DNA) מפעיל תגובות הביטחון מארח4,5,6. עם זאת, הקיום והשכיחות של חומצות גרעין החיסונית כגון כפול מסוג RNA (dsRNA) מינים של קרדית אבק הבית (HDM) או אלרגנים אחרים חרקים נשארים לא ידועים. פרוטוקול זה נועד לקבוע אם HDM או חרקים ואלרגנים שאינם חרקים מכילים מינים dsRNA ארוך שיכול להפעיל תגובה חיסונית הגנה לנטרל את ההתפתחות של דלקת ריאות אאוזינופילית חמורה במודל העכבר של אסתמה אלרגית. כאן, אנו מספקים שלוש שיטות פשוטות ומהירות כדי להעריך את דטרמיננטים מבניים ב-RNA הכולל HDM הדרושים עבור ויסות הנגרמת אלרגן לדלקת ריאות אאוזינופילית.
מערכת החיסון רירית היא האיבר החיסונית הגדול ביותר בגוף ומשמש כשורה הראשונה של הגנה מארחים מפני זיהומים מיקרוביאלית ועלבונות אלרגיות7,8. Dsrna ארוך, שכפול ביניים של וירוסים רבים, ידוע לתפקד כדפוס מולקולרי הקשורים הפתוגן (pamp) כדי לעורר בסיפוק תגובות מולדים באמצעות אגרה כמו קולטן 3 (TLR3) כדי לגרום לביטוי של אינטרפרון מגורה גנים (isgs)9,10,11,12,13,14. לאחרונה הראו כי HDM סך הכל RNA הכיל מבנים dsRNA, אשר upregulated הביטוי של ISGs ומופחת דלקת ריאות אאוזינופילית חמורה כאשר מנוהל באמצעות intratracheal במודל מורטין של אסתמה אלרגית הנגרמת על ידי מחלץ HDM15. חומרת דלקות ריאות נקבעת על-ידי ניתוח סוגי התאים החיסוניים בעזרת ברונכשיים (BAL) ורקמת ריאות דרך הזרימה cy,16,17,18,19,20.
פרוטוקול זה כולל שלוש assays: 1) זיהוי מהיר של מבנים dsrna עם כתם כתמי RNA באמצעות העכבר נוגדן בטיים אשר במיוחד נקשר dsrna (≥ 40bp) באופן עצמאי רצף; 2) הערכה מהירה להשפעות vivo של RNA מגירוי חיסוני בריאות העכבר על ידי מדידת אינדוקציה של ISGs באמצעות RT-qPCR; 3) כימות מדויק של אאוזיפרלס באל וריאה בהקשר של דלקת ריאות HDM המושרה באמצעות הזרימה cy, לנסות.
האמור לעיל ניתן להשתמש כדי ללמוד לא רק אלרגיות מחלות ריאות, אלא גם זיהומים בקטריאליים ונגיפי הנשימה. לדוגמה, הנוגדן J2 ספציפי של dsrna יכול לשמש גם ביישומים אחרים כגון כרומטוגרפיה של זיקה חיסוני, אימונוהיסטוכימיה, חיסוני מקושר אנזים (אליסה) ו מכתים חיסוני21,22,23. בנוסף, מספר יישומים במורד איסוף נוזל BAL יכול להיות מנוצל עבור כימות תוכן מסיסים כגון ציטוקינים ו נוגדנים באמצעות אליסה, ו הטרנססקריפט פרופיל של תאים באיירווייז (למשל, מכתשי מקרופאגים). למרות שיש מגוון פרוטוקולים הזמינים בספרות להערכת תנאי הריאות, רוב הפרוטוקולים הללו מתמקדים לעתים קרובות באימות היעד. ניתן ליישם את ההליכים המתוארים כאן על מנת לזהות רכיבים באלרגנים סביבתיים החשובים לוויסות ההתפתחות של מחלות אלרגיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להעריך את תכונות הגירוי החיסוני של מיקרוביאלית הקשורים אלרגן-RNA וההשפעות שלהם על התפתחות דלקת ריאות אאוזינופילית במודל העכבר של אסתמה אלרגית. למרות dsRNAs ארוך ידועים כintermediates השכפול של וירוסים רבים שיכולים להפעיל בסיפוק אינטרפרון תגובות בתאי היונקים, הנוכחות של?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לגב קרלה גורנה לקבלת סיוע טכני בזרימה ציטואסינסה. L.S. נתמכת על ידי מועצת המלגות סין והקרן לחדשנות מחוזי הונאן לתארים מתקדמים (CX201713068). H.H.A. נתמכת על ידי המחלקה למדעי המעבדה הקלינית, המכללה למדעי הרפואה היישומית, אוניברסיטת ג’ול, סאקקה, ערב הסעודית. X.D.L. נתמך על ידי בריאות UT סן אנטוניו בית הספר לרפואה הפעלה של הקרן מקס ו מינין Voelcker.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O’Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- . Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018)
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
