Identification et caractérisation des espèces d’ARN immunogéniques chez les allergènes HDM qui modulent l’inflammation pulmonaire éosinophile
Summary
Les allergènes environnementaux tels que les acariens domestiques (HDM) contiennent souvent des substances microbiennes qui activent les réponses immunitaires innées pour réguler l’inflammation allergique. Le protocole présenté ici démontre l’identification des espèces de dsRNA dans les allergènes de HDM et la caractérisation de leurs activités immunogéniques en modulant l’inflammation des poumons éosinophiles.
Abstract
Les allergènes environnementaux tels que les acariens domestiques (HDM) sont souvent sous des formes complexes contenant à la fois des protéines allergiques qui entraînent des réponses aberrantes de type 2 et des substances microbiennes qui induisent des réponses immunitaires innées. Ces composants microbiens associés aux allergènes jouent un rôle important dans la régulation du développement de conditions inflammatoires de type 2 telles que l’asthme allergique. Cependant, les mécanismes sous-jacents restent largement indéfinis. Le protocole présenté ici détermine les caractéristiques structurelles et l’activité in vivo de l’ARN immunostimularisé associé aux allergènes. Plus précisément, les allergènes communs sont examinés pour la présence d’espèces à double BRIN d’ARN (dsRNA) qui peuvent stimuler les réponses IFN dans les poumons et freiner le développement de l’éosinophilie pulmonaire grave dans un modèle de souris de l’asthme allergique induit par HDM. Ici, nous avons inclus les trois essais suivants: Dot blot pour montrer les structures dsRNA dans l’ARN total isolé des allergènes, y compris les espèces HDM, RT-qPCR pour mesurer les activités de l’ARN HDM dans l’expression des gènes stimulants de l’interféron (ISGs) dans les poumons de souris et l’analyse FACS pour déterminer les effets de l’ARN HDM sur le nombre d’éosinophiles dans BAL et poumon, respectivement.
Introduction
Sur la base de l’hypothèse d’hygiène initialement proposée par Strachan1, l’exposition de la petite enfance à des facteurs microbiens environnementaux tels que l’endotoxine peut protéger contre le développement de troubles allergiques2,3. Pendant les infections microbiennes, par exemple, les infections virales, la détection immunitaire innée des acides nucléiques étrangers (ARN/ADN) déclenche les réponses de défense de l’hôte4,5,6. Cependant, l’existence et la prévalence d’acides nucléiques immunogènes tels que les longues espèces d’ARN à double brin (ARN) dans les acariens domestiques (HDM) ou d’autres allergènes d’insectes demeurent inconnues. Ce protocole a été conçu pour déterminer si le HDM ou les allergènes d’insectes et de non-insectes contiennent de longues espèces de dsRNA qui peuvent activer une réponse immunitaire protectrice pour contrer le développement d’une inflammation pulmonaire éosinophile grave dans un modèle de souris d’asthme allergique. Ici, nous fournissons trois méthodes simples et rapides pour évaluer les déterminants structurels dans l’ARN total de HDM qui sont exigés pour réguler l’inflammation des poumons éosinophiles allergènes induites.
Le système immunitaire muqueuse est le plus grand organe immunitaire dans le corps et sert de première ligne de défense de l’hôte contre les infections microbiennes et les insultes allergiques7,8. Le long dsRNA, l’intermédiaire de réplication de nombreux virus, est connu pour fonctionner comme un modèle moléculaire associé à un pathogène (PAMP) pour stimuler puissamment les réponses innées via toll comme le récepteur 3 (TLR3) pour induire l’expression des gènes stimulés par l’interféron (ISGs)9,10,11,1212,13,14. Nous avons récemment montré que l’ARN total hdm contenait des structures dsRNA, qui ont upregulated l’expression des ISGs et réduit l’inflammation pulmonaire éosinophile grave lorsqu’il est administré par l’instillation intratrachéale dans un modèle murin d’asthme allergique induit par les extraits de HDM15. La gravité des inflammations pulmonaires est déterminée par l’analyse des types de cellules immunitaires dans le lavage bronchoalvéolaire (BAL) et le tissu pulmonaire par cytométrie de flux16,17,18,19,20.
Ce protocole comprend trois essais : 1) détection rapide des structures dsRNA avec tache de point d’ARN à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris J2 qui se lie spécifiquement à l’ARN (≥40bp) d’une manière séquence-indépendante ; 2) évaluation rapide des effets in vivo de l’ARN immunostimularisant dans les poumons de souris en mesurant l’induction des ISG à l’aide de RT-qPCR; 3) quantification précise des éosinophiles dans le BAL et le poumon dans le contexte de l’inflammation pulmonaire induite par hdm utilisant l’analyse de cytométrie de flux.
Les tests ci-dessus peuvent être utilisés pour étudier non seulement les maladies pulmonaires allergiques, mais aussi les infections bactériennes et virales respiratoires. Par exemple, l’anticorps J2 spécifique à l’ARND peut également être utilisé dans d’autres applications telles que la chromatographie d’immunoaffinité, l’immunohistorichemisme, l’analyse immunosorbent liée aux enzymes (ELISA) et l’immunostaining21,22,23. En outre, plusieurs applications en aval de la collecte de liquides BAL peuvent être utilisées pour quantifier les contenus solubles tels que les cytokines et les chimiokines à l’aide d’ELISA, et le profilage transcriptionnel des cellules dans les voies respiratoires (p. ex., macrophages alvéolaires). Bien qu’il existe une variété de protocoles disponibles dans la littérature pour évaluer les affections pulmonaires, la plupart de ces protocoles se concentrent souvent sur la validation cible. Les procédures décrites ici peuvent être appliquées pour identifier les composants des allergènes environnementaux qui sont importants pour réguler le développement de maladies allergiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole actuel décrit comment évaluer les propriétés immunostimulatoires de l’ARN microbien associé aux allergènes et leurs impacts sur le développement de l’inflammation des poumons éosinophiles dans un modèle de souris d’asthme allergique. Bien que les longs DsARN soient connus comme les intermédiaires de réplication de nombreux virus qui peuvent activer efficacement les réponses à l’interféron dans les cellules de mammifères, leurs présences dans les allergènes HDM ont été inconnues jus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mme Karla Gorena pour son assistance technique en cytométrie des flux. L.S. est soutenu par le China Scholarship Council et la Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. est soutenu par le Département des sciences du laboratoire clinique, College of Applied Medical Sciences, Jouve University, Sakaka, Arabie Saoudite. X.D.L. est soutenu par l’UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund et le Fonds Max et Minnei Voelcker.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
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