Identificatie en karakterisering van immunogene RNA-soorten bij HDM-allergenen die eosinofiele longontsteking moduleren
Summary
Milieuallergenen zoals huisstofmijt (HDM) bevatten vaak microbiële stoffen die aangeboren immuunreacties activeren om allergische ontstekingen te reguleren. Het hier gepresenteerde protocol toont de identificatie aan van dsRNA-soorten in HDM-allergenen en karakterisering van hun immunogene activiteiten bij het moduleren van eosinofiele longontsteking.
Abstract
Milieuallergenen zoals huisstofmijt (HDM) bevinden zich vaak in complexe vormen die zowel allergische eiwitten bevatten die afwijkende reacties van type 2 en microbiële stoffen stimuleren die aangeboren immuunreacties veroorzaken. Deze allergeen-geassocieerde microbiële componenten spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de ontwikkeling van type 2 ontstekingsaandoeningen zoals allergische astma. De onderliggende mechanismen blijven echter grotendeels ongedefinieerd. Het hier gepresenteerde protocol bepaalt de structurele kenmerken en in vivo activiteit van allergeen-geassocieerd immunostimulatorium RNA. Specifiek, gemeenschappelijke allergenen worden onderzocht op de aanwezigheid van dubbelstrengs RNA (dsRNA) soorten die IFN reacties in de longen kan stimuleren en de ontwikkeling van ernstige longeosinofilie in een muismodel van HDM-geïnduceerde allergische astma kunnen beperken. Hier hebben we de volgende drie tests opgenomen: Dot blot om de dsRNA-structuren in totale RNA-structuren te tonen die geïsoleerd zijn van allergenen, waaronder HDM-soorten, RT-qPCR om de activiteiten van HDM RNA in interferontimulerende genen (ISG’s) expressie in muislongen en FACS-analyse te meten om de effecten van HDM RNA op het aantal eosinofielen in BAL en long te bepalen, respectievelijk.
Introduction
Op basis van de hygiënehypothese die Strachan1oorspronkelijk voorstelde , kan blootstelling aan milieumicrobiële factoren zoals endotoxine beschermen tegen de ontwikkeling van allergische aandoeningen2,3. Tijdens microbiële infecties, bijvoorbeeld virale infecties, activeert de aangeboren immuundetectie van vreemde nucleïnezuren (RNA/DNA) hostverdedigingsreacties4,5,6. Het bestaan en de prevalentie van immunogene nucleïnezuren zoals lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) soorten in huisstofmijt (HDM) of andere insectenallergenen blijven echter onbekend. Dit protocol is ontworpen om te bepalen of HDM of insecten- en niet-insectenallergenen lange dsRNA-soorten bevatten die een beschermende immuunrespons kunnen activeren om de ontwikkeling van ernstige eosinofiele longontsteking in een muismodel van allergische astma tegen te gaan. Hier bieden we drie eenvoudige en snelle methoden om de structurele determinanten in HDM totaal RNA te evalueren die nodig zijn voor het reguleren van allergeen-geïnduceerde eosinofiele longontsteking.
Het slijmvlies immuunsysteem is het grootste immuunsysteem orgaan in het lichaam en dient als de eerste lijn van gastheer verdediging tegen zowel microbiële infecties en allergische beledigingen7,8. De lange dsRNA, de replicatie tussenliggende van vele virussen, staat bekend om te functioneren als een pathogen-geassocieerd moleculair patroon (PAMP) om krachtig te stimuleren aangeboren reacties via Toll like receptor 3 (TLR3) om de expressie van interferon gestimuleerd genen (ISG’s)9,10,11,12,13,14induceren . We hebben onlangs aangetoond dat HDM totale RNA bevatte dsRNA structuren, die upregulated de expressie van ISG’s en verminderde ernstige eosinofiele longontsteking wanneer toegediend via de intratracheale instillatie in een murine model van allergische astma geïnduceerd door HDM extracten15. De ernst van longontstekingen wordt bepaald door het analyseren van de immuunceltypen in bronchoalveolaire lavage (BAL) en longweefsel via flow cytometrie16,17,18,19,20.
Dit protocol bevat drie tests: 1) snelle detectie van dsRNA-structuren met RNA-puntvlek met behulp van een monoklonale antilichaam J2 van de muis, dat specifiek op een sequentieonafhankelijke manier aan het dsRNA (≥40bp) bindt; 2) snelle evaluatie van in vivo effecten van immunostimulatorium RNA in muislongen door het meten van de inductie van ISG’s met behulp van RT-qPCR; 3) nauwkeurige kwantificering van eosinofielen in BAL en long in de context van HDM-geïnduceerde longontsteking met behulp van flow cytometrie analyse.
De bovenstaande testen kunnen worden gebruikt om niet alleen allergische longziekten te bestuderen, maar ook respiratoire bacteriële en virale infecties. Zo kan het dsRNA-specifieke J2-antilichaam ook worden gebruikt in andere toepassingen zoals immunoaffiniteitschromatografie, immunohistochemie, enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) en immunostaining21,22,23. Bovendien kunnen verschillende toepassingen stroomafwaarts van BAL-vloeistofverzameling worden gebruikt voor het kwantificeren van oplosbare inhoud, zoals cytokines en chemokines met behulp van ELISA, en transcriptieprofilering van cellen in de luchtwegen (bijvoorbeeld alveolaire macrofagen). Hoewel er een verscheidenheid van protocollen beschikbaar in de literatuur om longaandoeningen te evalueren, de meeste van deze protocollen richten zich vaak op de doelvalidatie. De hier beschreven procedures kunnen worden toegepast om componenten in milieuallergenen te identificeren die belangrijk zijn voor het reguleren van de ontwikkeling van allergische ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol beschrijft hoe de immunostimulerende eigenschappen van allergeen-geassocieerd microbiële RNA en hun effecten op de ontwikkeling van eosinofiele longontsteking in een muismodel van allergische astma te evalueren. Hoewel lange dsRNAs bekend staan als de replicatie tussenproducten van vele virussen die krachtig interferonreacties in zoogdiercellen kunnen activeren, zijn hun aanwezigheid in HDM-allergenen onbekend tot ons recente werk15. De combinatie van RNA dot blot, RT-qPCR en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken mevrouw Karla Gorena voor technische bijstand bij stroomcytometrie. L.S. wordt ondersteund door de China Scholarship Council en Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. wordt ondersteund door de afdeling Klinische Laboratoriumwetenschappen, Hogeschool voor Toegepaste Medische Wetenschappen, Jouf University, Sakaka, Saoedi-Arabië. X.D.L. wordt ondersteund door het UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund en het Max en Minnei Voelcker Fund.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O’Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- . Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018)
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
