Контролируемое машинное обучение для полукоми оценке внеклеточной ДНК при гломерулонефрите
Summary
Экстраклеточная ДНК (ecDNA), выделяемая во время клеточной смерти, является провоспалительным и способствует воспалению. Измерение экДНА в месте травмы может определить эффективность терапевтического лечения в целевом органе. Этот протокол описывает использование инструмента машинного обучения для автоматизации измерения экДNA в тканях почек.
Abstract
Гломерулярная гибель клеток является патологической особенностью миелопоксидазы анти neutrophil цитоплазматических антител, связанных с васкулитом (MPO-AAV). Внеклеточная дезоксирибонуклеиновая кислота (ecDNA) высвобождается при различных формах смерти клеток, включая апоптоз, некроптоз, внеклеточные ловушки нейтрофила (NETs) и пироптоз. Измерение этой смерти клеток занимает много времени с несколькими различными биомаркеры, необходимые для выявления различных биохимических форм смерти клеток. Измерение экДНА, как правило, проводится в сыворотке крови и моче в качестве суррогата для повреждения почек, а не в фактическом целевом органе, где происходит патологическое повреждение. В настоящее время трудности в расследовании экДНК в почках является отсутствие методов для формалин фиксированной парафин встроенной ткани (FFPE) как экспериментально, так и в архивных биопсий почек человека. Этот протокол содержит резюме шагов, необходимых для пятна для ecDNA в ткани FFPE (как человека, так и мурина), утолить автоматическое утоление и измерить ecDNA в результате изображения с помощью инструмента машинного обучения из общедоступного открытого исходного кода ImageJ плагин обучаемой сегментации Weka. Обучаемая сегментация Weka применяется к ecDNA в гломерули, где программа учится классифицировать ecDNA. Этот классификатор применяется к последующим приобретенным изображениям почек, уменьшая потребность в ручных аннотациях каждого отдельного изображения. Адаптивность обучаемой сегментации Weka продемонстрирована далее в тканях почек от экспериментального мурина анти-МПО гломерулонефрит (GN), для выявления NETs и ecMPO, общие патологические вклады в анти-MPO GN. Этот метод обеспечивает объективный анализ экДНК в тканях почек, что наглядно демонстрирует эффективность, при которой программа сегментации Weka может различать экДНК между здоровой нормальной почечной тканью и больной почечной тканью. Этот протокол можно легко адаптировать для идентификации ecDNA, NETs и ecMPO в других органах.
Introduction
Myeloperoxidase анти neutrophil цитоплазматические антитела, связанные васкулит (MPO-AAV) является аутоиммунным заболеванием, что приводит к почечной недостаточности от патологических гломерулярных травм со значительной гибели клеток и высвобождение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)1,2. ДНК может активировать иммунную систему, действуя в качестве сигнала опасности. При нормальных здоровых условиях, ядерное расположение ДНК обеспечивает защиту от воздействия иммунной системы. СамоОНК, которая высвобождается внеклеточно либо в результате патогенных процессов или аутоиммунных рассматривается иммунной системой как мощное провоспалительные повреждения, связанные с молекулярным самобелем (DAMP)3. Дополнительная клеточная ДНК (ecDNA) высвобождается из умирающих клеток через несколько различных механизмов, которые регулируются различными биохимическими путями, такими как апоптоз, некроптоз нейтрофил внеклеточной ловушки формирования (NETs), некроз или пироптоз4,5,6,7,8.
Мы описываем здесь методы, чтобы пятно и мера ecDNA освобождены от умирающих клеток в разделах формалин фиксированной парафин встроенных (FFPE) почки из экспериментальных анти-MPO GN и биопсии почек от пациентов с MPO-AAV9,10. Существует множество методов для обнаружения циркулирующих двойных мель ДНК (dsDNA) и ДНК комплексов из сыворотки и мочи и из пробирки анализ11,12. Эти методы, хотя и точны в определении количества ecDNA, не определить, где ecDNA высвобождается анатомически. Есть методы, которые описывают конкретные измерения ecDNA, такие как тюля для апоптоза и измерения клеточного мусора13,14. Существует не метод, который описывает измерения ecDNA кульминацией из всех форм смерти клеток в почках FFPE, где патологические повреждения происходят. Это важно, чтобы определить, если экспериментальные терапевтические процедуры очистки ecDNA от сайтов патологических травм в фактическом целевом органе.
Приобретение нескольких изображений из образцов почек создает большой объем данных, которые обычно анализируются одним пользователем. Это трудоемкий, трудоемкий, отнимает много времени и может быть предметом ненадежной воспроизводимости других пользователей, из-за предвзятости пользователя. Обучаемая сегментация Weka является плагином программного обеспечения с открытым исходным кодом для ImageJ, который использует передний край биоинформатических инструментов для классификации пикселей с помощью алгоритмов машинного обучения15,,16. Этот метод является “обучаемым”, в соответствии с которым он учится на классификации пользователем сегментов пикселей и применяет новую классификацию узнал к другим изображениям. Этот метод опирается на общие инструменты анализа в программе ImageJ, которые используются для “классификации” каждого пикселя в сегменте как принадлежащих к определенному “классу”. Как только программа узнает о “классификаторах”, они могут быть использованы для идентификации других аналогичных классифицированных сегментов в пределах одного и того же изображения. Затем эта модель сохраняется и применяется к другим наборам изображений в рамках того же эксперимента.
Текущие препятствия для определения ecDNA на месте в секциях почек является эндогенной аутофлюоресценции от фиксации в формалин и трудоемкий анализ изображений. Мы описываем здесь, как утолить эту аутофлюоресценцию, обнаружить ecDNA, и использовать контролируемое машинное обучение для измерения высокой пропускной способности ecDNA. Ранее мы опубликовали измерения NETs и внеклеточного MPO (ecMPO) с использованием макро в ImageJ, теперь мы демонстрируем полу автоматизации этих методов с использованием контролируемого машинного обучения1. Мы демонстрируем адаптивность инструмента машинного обучения, чтобы классифицировать альтернативное пятно для NETs и ecMPO в пределах одного изображения. Эти методы окрашивания, описанные здесь для обнаружения ecDNA, NETs и ecMPO могут быть переведены на другие твердые органы и заболевания, где ecDNA, NETS и ecMPO играет роль в увековечении таких заболеваний, как ревматоидный артрит и волчанка17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует несколько протоколов, которые измеряют провоспалительные маркеры в сыворотке крови и моче как пациентов, так и мышиных моделей гломерулонефрита. Этот описанный протокол позволяет напрямую анализировать продукты клеточной смерти (ecDNA, NETs и ecMPO) в пределах гломерула. Наиболее…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем, Monash Micro Imaging для использования Nikon C1 вертикально конфокальный лазерный сканирующий микроскоп и Монаш гистологии платформы для обработки тканей почек.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
References
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
