In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

O neocórtex é a folha externa do cerebrum mamífero e a sede de funções cognitivas mais altas^1,,2,3,4,5. Para alcançar uma manipulação genética aguda no neocórtex mamífero in vivo durante o desenvolvimento embrionário, dois métodos diferentes foram explorados: infecção viral⁶ e na eletroporação^{uterónica 7}. Ambos os métodos permitem um direcionamento eficiente de células neocorticais, mas sofrem de algumas limitações. A maior vantagem da eletroporação uteiremida em relação à infecção viral é a capacidade de alcançar especificidade espacial dentro do neocórtex, que é alcançado pela regulação da direção do campo elétrico.

Desde que a eletroporação foi mostrada pela primeira vez para facilitar a entrada de DNA nas células in vitro^8,ela foi aplicada para entregar DNA em vários vertebrados in vivo. Na neurociência do desenvolvimento, a eletroporação utero do neocórtex do camundongo foi relatada pela primeira vez em 2001^9,10. Este método consiste em uma injeção da mistura de DNA no ventrículo lateral do cérebro embrionário e posterior aplicação do campo elétrico usando eletrodos de pinça, o que permite precisão espacial^7,,11. A eletroporação utero tem sido aplicada desde então para fornecer ácidos nucleicos a fim de manipular a expressão de genes endógenos ou emplacados no neocórtex do camundongo. Importantes progressos foram feitos recentemente, aplicando a metodologia de edição de genoma mediado por CRISPR/Cas9 via eletroporação utero no neocórtex do camundongo para realizar (1) interrupção genética nos neurônios pós-metóticos^12,,13 e células progenitoras neurais¹⁴, e (2) genoma¹⁵ e edição epigenome^16.

Logo após o primeiro relato em camundongos, na eletroporação uterónica foi aplicado ao neocórtex de rato embrionário^17,18. Os não roedores permaneceram um desafio até que a primeira eletroporação uterópica de furões, um pequeno carnívoro, foi relatada em 2012^19,20. Desde então, no útero a eletroporação de furões tem sido aplicada para estudar os mecanismos de desenvolvimento do neocórtex rotulando progenitores neurais e neurônios^20,21,22,,23, manipulando a expressão de genes endógenos, incluindo o uso da tecnologia CRISPR/Cas9²⁴, e fornecendo genes ectópicos^21,22,,25, incluindo genes humanos-específicos²⁶. Além disso, a eletroporação utero de furões tem sido usada para abordar características do desenvolvimento do neocórtex humano em condições patológicas^27,28.

No contexto do desenvolvimento do neocórtex, as vantagens de usar furões como organismo modelo em comparação com camundongos se devem ao fato de que os furões melhor recapitulam uma série de características humanas. No nível anatômico, os furões exibem um padrão característico de dobramento cortical, que também está presente no ser humano e na maioria dos outros primatas, mas está completamente ausente em camundongos ou ratos^{4,,29,,30,,31}. No nível histológico, os furões têm duas zonas germinals subventriculares distintas, conhecidas como zonas subventriculares internas e externas (ISVZ e OSVZ,^{respectivamente) 32,33}, separadas pela camada interna de fibra²³. Essas características também são compartilhadas com primatas, incluindo humanos, mas não com camundongos³⁴. O ISVZ e o OSVZ em furões e humanos são povoados com abundantes células progenitoras neurais, enquanto a zona subventricular (SVZ) de camundongos contém apenas progenitores neurais esparsos^{21,,32,,35,,36}. A nível celular, os furões apresentam uma alta proporção de um subtipo de progenitores neurais referidos como glia radial basal ou externa (bRG ou oRG, respectivamente), que são considerados instrumentais para a expansão evolutiva do neocórtex mamífero^34,,37,38. bRG são, portanto, altamente abundantes no neocórtex do furão humano e embrionário fetal, mas são muito raros no neocórtex do camundongo embrionário^35,36. Além disso, o furão bRG apresenta heterogeneidade morfológica semelhante à do bRG humano, muito superior ao do mouse bRG²¹. Finalmente, em nível molecular, o desenvolvimento do neocórtex furão mostra padrões de expressão genética altamente semelhantes aos do neocórtex humano fetal, que presume-se controlar o desenvolvimento da dobra cortical, entre outras coisas³⁹.

As características biológicas e moleculares das características biológicas e moleculares do furão bRG tornam-nas altamente proliferativas, semelhantes à bRG humana. Isso resulta em um aumento da produção de neurônios e desenvolvimento de um neocórtex expandido e altamente complexo³⁴. Essas características tornam os furões excelentes organismos modelo para estudar características humanas do desenvolvimento de neocórtex que não podem ser modelados em camundongos^26,40. Para aproveitar ao máximo o furão como organismo modelo, foi desenvolvido o método apresentado. Consiste na eletroporação uterópica de embriões furões furões E33 com um plasmídeo expressando GFP (pGFP) sob o controle de um promotor onipresente, CAG. Os embriões eletroporados podem então ser analisados embrionáriamente ou postalmente. Para reduzir o número de animais sacrificados, os furões fêmeas (jills) são esterilizados pela histerectomia e doados para adoção como animais de estimação. Se os embriões-alvo forem colhidos em estágios embrionários, uma segunda cirurgia é realizada e os embriões são removidos por cesariana, enquanto os jills são histerectomizados. Se os embriões-alvo forem analisados em estágios pós-natal, os jills são histerectomizados após os filhotes serem desmamados ou sacrificados. Por isso, também é apresentado um protocolo para a histerectomia dos jills.