In Vivo Targeting di cellule progenitrici neurali in Ferret Neocortex di In Utero Electroporation

La neocorteccia è il foglio esterno del cervello dei mammiferi e la sede delle funzioni cognitive superiori^1,2,3,4,5. Per ottenere una manipolazione genetica acuta nella neocorteccia di mammifero in vivo durante lo sviluppo embrionale, sono stati esplorati due diversi metodi: l’infezione virale⁶ e l’elettroporazione utero⁷. Entrambi i metodi consentono un targeting efficiente delle cellule neocorticali, ma soffrono di alcune limitazioni. Il principale vantaggio dell’elettroporazione in utero rispetto all’infezione virale è la capacità di raggiungere la specificità spaziale all’interno della neocorteccia, che si ottiene regolando la direzione del campo elettrico.

Dal momento che l’elettroporazione è stata dimostrata per facilitare l’ingresso del DNA nelle cellule in vitro⁸, è stato applicato per fornire il DNA in vari vertebrati in vivo. Nella neuroscienza dello sviluppo, in utero l’elettroporazione della neocorteccia del topo è stata riportata per la prima volta nel 2001^9,10. Questo metodo consiste in un’iniezione della miscela di DNA nel ventricolo laterale del cervello embrionale e dalla successiva applicazione del campo elettrico utilizzando elettrodi tweezer, che consente la precisione spaziale^7,11. In utero l’elettroporazione è stata poi applicata per fornire acidi nucleici al fine di manipolare l’espressione di geni endogeni o aggiunti ectopicamente nella neocorteccia del topo. Recentemente sono stati compiuti importanti progressi applicando la metodologia dell’editing del genoma mediato da CRISPR/Cas9 tramite l’elettroporazione in utero nella neocorteccia del topo per eseguire (1) l’interruzione genica nei neuroni postmitotici^12,13 e le cellule progenitrici^{neurali 14}e (2) il genoma¹⁵ e l’epigenoma^16.

Poco dopo il primo rapporto nel topo, in utero l’elettroporazione è stata applicata alla neocorteccia di ratto^{embrionale 17,18}. I non roditori sono rimasti una sfida fino a quando il primo in utero elettroporazione di furetti, un piccolo carnivoro, è stato segnalato nel 2012^19,20. Da allora, in utero l’elettroporazione dei furetti è stata applicata per studiare i meccanismi di sviluppo della neocorteccia etichettando progenitori neurali e neuroni^20,21,22,23, manipolando l’espressione di geni endogeni, compreso l’uso della tecnologia CRISPR/Cas9²⁴, e fornendo geni ectopici^21,22,25, compresi i geni specifici dell’uomo²⁶. Inoltre, in utero l’elettroporazione dei furetti è stata utilizzata per affrontare le caratteristiche dello sviluppo umano della neocorteccia in condizioni^{patologiche 27,28}.

Nel contesto dello sviluppo della neocorteccia, i vantaggi dell’uso dei furetti come organismo modello rispetto ai topi sono dovuti al fatto che i furetti ricapitolano meglio una serie di caratteristiche simili a quella umana. A livello anatomico, i furetti presentano un caratteristico modello di piegatura corticale, che è presente anche nell’uomo e nella maggior parte degli altri primati, ma è completamente assente nei topi o nei ratti^4,29,30,31. A livello istologico i furetti hanno due distinte zone germicolari subventricolari, denominate zone subventricolari interne ed esterne (rispettivamente ISV e OSV)^32,33, separate dallo strato di fibra^{interna 23}. Queste caratteristiche sono condivise anche con i primati, compresi gli esseri umani, ma non con i^{topi 34}. I fursoli e gli esseri umani sono popolati da abbondanti cellule progenitrici neurali, mentre la zona subventricolare (SV) dei topi contiene solo progenitori neurali sparse^21,32,35,36. A livello cellulare, i furetti presentano un’alta percentuale di un sottotipo di progenitori neurali denominati glia radiali basali o esterni (rispettivamente bRG o oRG), che sono considerati strumentali per l’espansione evolutiva della neocorteccia mammifera^34,37,38. BRG sono quindi molto abbondanti nella neocorteccia di furetti umani ed embrionali fetali, ma sono molto rari nella neocorteccia di topo embrionale^35,36. Inoltre, il furetto bRG mostra un’eterogeneità morfologica simile a quella della bRG umana, di gran lunga superiore al topo bRG²¹. Infine, a livello molecolare, lo sviluppo della neocorteccia di furetti mostra modelli di espressione genica molto simili a quelli della neocorteccia umana fetale, che si presume controllino lo sviluppo del ripiegamento corticale, tra le altre^{cose 39}.

Le caratteristiche biologiche e molecolari delle cellule del furetto bRG le rendono altamente proliferative, simili a bRG umane. Ciò si traduce in una maggiore produzione di neuroni e lo sviluppo di una neocorteccia espansa e altamente complessa³⁴. Queste caratteristiche rendono i furetti eccellenti organismi modello per lo studio delle caratteristiche umane dello sviluppo della neocorteccia che non possono essere modellate nei^{topi 26,40}. Per sfruttare appieno il furetto come organismo modello è stato sviluppato il metodo presentato. Consiste nell’elettroporazione in utero di embrioni di furetti E33 con un plasmide che esprime GFP (pGFP) sotto il controllo di un promotore onnipresente, CAG. Gli embrioni elettroporati possono quindi essere analizzati embrionalmente o postnatalmente. Al fine di ridurre il numero di animali sacrificati, i furetti femminili (jills) vengono sterilizzati dall’isterectomia e donati per l’adozione come animali domestici. Se gli embrioni mirati vengono raccolti in fasi embrionali, viene eseguito un secondo intervento chirurgico e gli embrioni vengono rimossi da un taglio cesareo, mentre le jills sono isterectomizzate. Se gli embrioni mirati vengono analizzati in fasi postnatali, le jill vengono isterectomizzate dopo che i cuccioli sono stati svezzati o sacrificati. Quindi, viene presentato anche un protocollo per l’isterectomia delle jills.