Estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por pseudomonas en células epiteliales pulmonares

El tabaquismo afecta la salud pública de millones de personas en todo el mundo. Muchas enfermedades notorias, incluyendo el cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), se han notificado relacionadas con el tabaquismo^1,2. Fumar cigarrillos aumenta la susceptibilidad a las infecciones microbianas agudas en el sistema respiratorio^3,4,5. Además, la creciente evidencia demuestra que fumar cigarrillos mejora la patogénesis de muchos trastornos crónicos^6,,7,,8. Por ejemplo, fumar cigarrillos puede aumentar las infecciones virales o bacterianas que causan exacerbación de la EPOC⁹. Entre los patógenos bacterianos que contribuyen etiológicamente a la exacerbación aguda de la EPOC, un patógeno del bacilo gramnegativo oportunista, Pseudomonas aeruginosa,provoca infecciones que se correlacionan con los malos pronósticos y las mayores mortalidades^10,11. La exacerbación de la EPOC empeora la enfermedad al acelerar la progresión patológica. No existen terapias eficaces contra la exacerbación de la EPOC, excepto para el manejo antisintomático¹². La exacerbación de la EPOC promueve la mortalidad de los pacientes, disminuye la calidad de vida y aumenta la carga económica para la sociedad¹³.

Las vías respiratorias son un sistema abierto, sometido continuamente a diversos patógenos microbianos presentes externamente. Los patógenos bacterianos oportunistas se detectan generalmente en las vías respiratorias superiores, pero a veces se observan en las vías respiratorias inferiores^14,15. En los modelos animales P. aeruginosa se puede detectar en sacos alveolares tan pronto como 1 h después de la infección¹⁶. Como un mecanismo de defensa importante, las células inmunitarias como los macrófagos o los neutrófilos eliminan las bacterias de las vías respiratorias. Las células epiteliales pulmonares, como la primera barrera fisiológica, desempeñan un papel único en la defensa del huésped contra las infecciones microbianas. Las células epiteliales pulmonares pueden regular la invasión microbiana, la colonización o la replicación independientemente de las células inmunitarias¹⁷. Algunas moléculas encontradas en las células epiteliales, incluyendo PPARg, ejercen funciones antibacterianas, regulando así la colonización bacteriana y la replicación en las células epiteliales pulmonares¹⁸. Fumar cigarrillos puede alterar las moléculas y afectar la función normal de defensa en las células epiteliales pulmonares^19,20. Estudios recientes informaron de la exposición directa del humo del cigarrillo a las células epiteliales pulmonares utilizando el aparato robótico de fumar^21,22. Sin embargo, la exposición al humo se puede realizar de otras maneras, incluida la aplicación de la EEB. La preparación de la EEB es un enfoque reproducible con posibles aplicaciones en otros tipos de células, incluidas las células endoteliales vasculares que están indirectamente expuestas al humo del cigarrillo.

Este informe describe un protocolo para generar extracto de humo de cigarrillo para alterar la carga bacteriana en las células epiteliales pulmonares. La EEB aumenta la carga bacteriana de P. aeruginosa,y puede contribuir a la recurrencia de infecciones bacterianas generalmente observadas en la exacerbación de la EPOC. Se utiliza un método convencional para la preparación de la EEB. Las células epiteliales pulmonares, en su etapa de crecimiento exponencial, se tratan con 4% de EEB durante 3 h. Alternativamente, las células epiteliales pulmonares cultivadas en monocapa pueden exponerse directamente al humo del cigarrillo en una interfaz aire-líquido. Las células tratadas con CSE se enfrentan a los desafíos con Pseudomonas en una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las bacterias se propagan a una velocidad de agitación particular para asegurar que la morfología de su flagela permanezca intacta para conservar toda su capacidad invasiva. La gentamicina se emplea para matar las bacterias que quedan en el medio de cultivo, reduciendo así la contaminación potencial durante la posterior determinación de la carga bacteriana. El protocolo también utiliza Pseudomonasetiquetada por GFP, que ha sido utilizado como una poderosa herramienta en el estudio de la infección por Pseudomonas en diferentes modelos. Una cepa representativa es Migula²³de P. fluorescen. El grado de infección o carga bacteriana después del tratamiento de la CSE se determina de tres maneras: el método de placa de caída con recuento de colonias, PCR cuantitativo utilizando imprimaciones específicas de Pseudomonas 16S rRNA, o citometría de flujo en células infectadas con Pseudomonasfluorescentes. Este protocolo es un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.