מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות
Summary
מתואר כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד כיצד תמצית עשן סיגריות משפיעה על קולוניזציה חיידקים בתאי אפיתל ריאות.
Abstract
עישון סיגריות הוא הגורם האטיולוגי העיקרי לנפחת ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). עישון סיגריות גם מקדם רגישות לזיהומים חיידקיים במערכת הנשימה. עם זאת, ההשפעות של עישון סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות אנושיים עדיין לא נחקרו ביסודיות. מתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט להכנת תמציות עישון סיגריות (CSE), טיפול בתאי אפיתל ריאות אנושיים עם CSE, זיהום חיידקי וקביעת זיהום. CSE הוכן בשיטה קונבנציונלית. תאי אפיתל ריאות טופלו עם 4% CSE עבור 3 שעות. תאים שטופלו CSE היו, אז, נגועים פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. עומסים חיידקיים של התאים נקבעו על ידי שלוש שיטות שונות. התוצאות הראו כי CSE גדל עומס פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות. פרוטוקול זה, לכן, מספק גישה פשוטה ושחזור כדי ללמוד את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.
Introduction
עישון סיגריות משפיע על בריאות הציבור של מיליוני אנשים ברחבי העולם. מחלות מזיקות רבות, כולל סרטן ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), מדווחים להיות קשורים עישון סיגריות1,,2. עישון סיגריות מגביר את הרגישות לזיהומים מיקרוביאליים חריפים במערכתהנשימה 3,4,5. יתר על כן, הצטברות ראיות מוכיחה כי עישון סיגריות משפר את הפתוגנזה של הפרעותכרוניות רבות 6,7,8. לדוגמה, עישון סיגריות עלול להגביר זיהומים ויראליים או חיידקיים הגורמים להחרפה COPD9. בין הפתוגנים החיידקיים התורמים באופן אטיאולוגי להחמרה חריפה של COPD, פתוגן באקלוס אופורטוניסטי-שלילי, פסאודומונס ארוגינוזה, גורם לזיהומים המתאם עם פרוגנוזה עניים ותמותהגבוהה יותר 10,11. החמרת COPD מחמירה את המחלה על ידי האצת ההתקדמות הפתולוגית. אין טיפולים יעילים נגד החמרה COPD למעט ניהול אנטי-סמפטומטי12. החמרת COPD מקדמת תמותת חולים, מפחיתה את איכות החיים ומגבירה את הנטל הכלכלי עלהחברה 13.
דרכי הנשימה היא מערכת פתוחה, נתון ברציפות פתוגנים מיקרוביאליים שונים נוכחים מבחוץ. פתוגנים חיידקיים אופורטוניסטיים מזוהים בדרך כלל בדרכי הנשימה העליונות, אך לעתים נצפו בדרכי הנשימההתחתיות 14,15. במודלים של בעלי חיים P. aeruginosa ניתן לזהות בבקבי alveolar ברגע 1 שעה לאחר זיהום16. כמנגנון הגנה מרכזי, תאים חיסוניים כגון מקרופאגים או נויטרופילים לחסל את החיידקים בדרכי הנשימה. תאי אפיתל ריאות, כמו המחסום הפיזיולוגי הראשון, לבצע תפקיד ייחודי בהגנה המארח מפני זיהומים מיקרוביאליים. תאי אפיתל ריאות עשויים לווסת פלישה מיקרוביאלית, קולוניזציה, או שכפול ללא תלות בתאים חיסוניים17. מולקולות מסוימות שנמצאו בתאי אפיתל, כולל PPARg, להפעיל פונקציות אנטיבקטריאליות, ובכך ויסות קולוניזציה חיידקים שכפול בתאי אפיתלריאות 18. עישון סיגריות עשוי לשנות את המולקולות ולפגוע בתפקוד ההגנה הנורמלי בתאיאפיתל ריאות 19,20. מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על חשיפה ישירה של עשן סיגריות לתאי אפיתלריאות באמצעות 21,22. חשיפה לעשן יכולה להתבצע בדרכים אחרות, עם זאת, כולל יישום של CSE. הכנת CSE היא גישה לשחזור עם יישומים פוטנציאליים בסוגי תאים אחרים, כולל תאי אנדותל כלי דם החשופים בעקיפין לעשן סיגריות.
דו”ח זה מתאר פרוטוקול כדי ליצור תמצית עשן סיגריה כדי לשנות את העומס חיידקים בתאי אפיתל ריאות. CSE מגביר העומס החיידקי של P. aeruginosa, וזה עשוי לתרום הישנות של זיהומים חיידקיים בדרך כלל לראות בהחמרה COPD. שיטה קונבנציונלית משמשת להכנת CSE. תאי אפיתל ריאות, בשלב הצמיחה המעריכי שלהם, מטופלים עם 4% CSE עבור 3 שעות. לחלופין, תאי אפיתל ריאות חד שכבתיים יכולים להיחשף ישירות לעשן סיגריות בממשק נוזלי אוויר. תאים שטופלו CSE לאחר מכן מאותגרים עם פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. החיידקים מופצים במהירות רועדת מסוימת כדי להבטיח את המורפולוגיה של הטלגלה שלהם נשאר שלם כדי לשמור על הקיבולת הפולשנית המלאה שלהם. Gentamycin מועסק להרוג את החיידקים שנותרו במדיום התרבות, ובכך להפחית את הזיהום הפוטנציאלי במהלך הקביעה הבאה של העומס החיידקי. הפרוטוקול משתמש גם בפסאודומונס עם תוויתGFP , אשר נוצל ככלי רב עוצמה בחקר זיהום פסאודומונס במודלים שונים. זן מייצג הוא P. פלואורסן של מיגולה23. מידת הזיהום או העומס החיידקי לאחר טיפול CSE נקבעת בשלוש דרכים: שיטת צלחת הטיפה עם ספירת מושבה, PCR כמותי באמצעות פריימרים ספציפיים Pseudomonas 16S rRNA, או ציתומיה זרימה בתאים נגועים פסאודומונס פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גישה פשוטה לשחזור כדי לחקור את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פלישה חיידקית לתאי אפיתל ריאות היא צעד מכריע בפתוגנזה של זיהומים חיידקיים. התהליך של פלישה חיידקית לתאים יכול להיות מחולק לתוך שלושת השלבים הבאים: הראשון, מגע החיידקים ולדבוק על פני השטח של תא האפיתל באמצעות flagella שלהם. שנית, החיידקים עוברים הפניה או חודרים את קרום התא. לבסוף, החיידקים לשכפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 מענקים HL125435 ו HL142997 (ל CZ).
Materials
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
