Étude des effets de la fumée de cigarette sur l’infection de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires

Le tabagisme affecte la santé publique de millions de personnes dans le monde. De nombreuses maladies nocives, y compris le cancer du poumon et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), seraient liées au tabagisme^1,2. Le tabagisme augmente la susceptibilité aux infections microbiennes aiguës dans le système respiratoire^3,4,5. En outre, les preuves de montage prouvent que le tabagisme améliore la pathogénie de nombreux troubles chroniques^6,7,8. Par exemple, le tabagisme peut augmenter les infections virales ou bactériennes qui causent l’exacerbation de la MPOC⁹. Parmi les pathogènes bactériens qui contribuent étiologiquement à l’exacerbation aiguë de la MPOC, un pathogène gramme-négatif opportuniste bacillus, Pseudomonas aeruginosa, provoque des infections qui se corrélent avec de faibles pronostics et des mortalités plus élevées^10,11. L’exacerbation de la MPOC aggrave la maladie en accélérant la progression pathologique. Il n’existe pas de thérapies efficaces contre l’exacerbation de la MPOC, à l’exception de la prise en charge antisymptomatique¹². L’exacerbation de la MPOC favorise la mortalité des patients, diminue la qualité de vie et augmente le fardeau économique pour la société¹³.

Les voies respiratoires sont un système ouvert, continuellement soumis à divers agents pathogènes microbiens présents à l’extérieur. Des agents pathogènes bactériens opportunistes sont habituellement détectés dans les voies respiratoires supérieures, mais sont parfois observés dans les voies respiratoires inférieures^14,15. Dans les modèles animaux P. aeruginosa peut être détecté dans les sacs alvéolaires dès 1 h après l’infection¹⁶. En tant que mécanisme de défense majeur, les cellules immunitaires telles que les macrophages ou les neutrophiles éliminent les bactéries dans les voies respiratoires. Les cellules épithéliales pulmonaires, en tant que première barrière physiologique, jouent un rôle unique dans la défense de l’hôte contre les infections microbiennes. Les cellules épithéliales pulmonaires peuvent réguler l’invasion microbienne, la colonisation ou la réplication indépendamment des cellules immunitaires¹⁷. Certaines molécules présentes dans les cellules épithéliales, y compris PPARg, exercent des fonctions antibactériennes, régulant ainsi la colonisation bactérienne et la réplication dans les cellules épithéliales pulmonaires¹⁸. Le tabagisme peut altérer les molécules et altérer la fonction de défense normale dans les cellules épithéliales pulmonaires^19,20. Des études récentes ont rapporté l’exposition directe de la fumée de cigarette aux cellules épithéliales de poumon utilisant l’appareil de tabagisme de robot^21,22. Toutefois, l’exposition à la fumée peut être effectuée d’autres façons, y compris l’application du CST. La préparation du CST est une approche reproductible avec des applications potentielles dans d’autres types de cellules, y compris les cellules endothéliales vasculaires qui sont indirectement exposées à la fumée de cigarette.

Ce rapport décrit un protocole pour générer l’extrait de fumée de cigarette pour modifier la charge bactérienne dans les cellules épithéliales de poumon. CST augmente la charge bactérienne de P. aeruginosa, et il peut contribuer à la récurrence des infections bactériennes habituellement observées dans l’exacerbation de la MPOC. Une méthode conventionnelle est utilisée pour la préparation du CST. Les cellules épithéliales pulmonaires, à leur stade de croissance exponentielle, sont traitées avec 4% de CST pendant 3 h. Alternativement, les cellules épithéliales pulmonaires de culture monocouche peuvent être directement exposées à la fumée de cigarette dans une interface air-liquide. Les cellules traitées au CSE sont ensuite défiées avec pseudomonas à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Les bactéries sont propagées à une vitesse de secousse particulière pour s’assurer que la morphologie de leur flagelle reste intacte pour conserver leur pleine capacité invasive. La gentamycine est utilisée pour tuer les bactéries laissées dans le milieu de culture, réduisant ainsi la contamination potentielle pendant la détermination ultérieure de la charge bactérienne. Le protocole utilise également pseudomonasétiqueté GFP , qui a été utilisé comme un outil puissant dans l’étude de l’infection Pseudomonas dans différents modèles. Une souche représentative est P. fluorescens Migula²³. Le degré d’infection ou de charge bactérienne après le traitement du CST est déterminé de trois façons : la méthode de la plaque de chute avec le comptage des colonies, le PCR quantitatif à l’aide d’amorces spécifiques à pseudomonas 16S, ou la cytométrie de flux dans les cellules infectées par des pseudomonas fluorescents. Ce protocole est une approche simple et reproductible pour étudier l’effet de la fumée de cigarette sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires.