Het bestuderen van effecten van sigarettenrook op pseudomonas infectie in longepitheelcellen
Summary
Hier beschreven is een protocol om te bestuderen hoe sigarettenrook extract bacteriële kolonisatie in longepelliële cellen beïnvloedt.
Abstract
Het roken van sigaretten is de belangrijkste etiologische oorzaak voor longemfyseem en chronische obstructieve longziekte (COPD). Het roken van sigaretten bevordert ook de gevoeligheid voor bacteriële infecties in de luchtwegen. Echter, de effecten van het roken van sigaretten op bacteriële infecties in menselijke long epitheelcellen moeten nog grondig worden bestudeerd. Hier beschreven is een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding van sigaretten roken extracten (CSE), behandeling van menselijke long epitheelcellen met CSE, en bacteriële infectie en infectie bepaling. CSE werd bereid met een conventionele methode. Longepeppitheelcellen werden behandeld met 4% CSE voor 3 h. CSE-behandelde cellen werden toen besmet met Pseudomonas bij een veelheid van infectie (MOI) van 10. Bacteriële belastingen van de cellen werden bepaald door drie verschillende methoden. De resultaten toonden aan dat CSE de pseudomonasbelasting in longepelleelcellen verhoogde. Dit protocol biedt daarom een eenvoudige en reproduceerbare aanpak om het effect van sigarettenrook op bacteriële infecties in longepeleliële cellen te bestuderen.
Introduction
Het roken van sigaretten beïnvloedt de volksgezondheid van miljoenen mensen wereldwijd. Veel schadelijke ziekten, waaronder longkanker en chronische obstructieve longziekte (COPD), worden gemeld te worden gerelateerd aan het roken van sigaretten1,2. Het roken van sigaretten verhoogt de gevoeligheid voor acute microbiële infecties in het ademhalingssysteem3,4,5. Bovendien blijkt uit toenemend bewijs dat het roken van sigaretten de pathogenese van veel chronische aandoeningen6,7,8versterkt . Bijvoorbeeld, het roken van sigaretten kan verhogen virale of bacteriële infecties die COPD verergering veroorzaken9. Onder de bacteriële pathogenen die etiologisch bijdragen aan acute verergering van COPD, een opportunistische gram-negatieve bacillus pathogene, Pseudomonas aeruginosa, veroorzaakt infecties die correleren met slechte prognoses en hogere sterftecijfers10,11. COPD-exacerbatie verergert de ziekte door de pathologische progressie te versnellen. Er zijn geen effectieve therapieën tegen COPD-exacerbatie, behalve voor het antisymptomatische beheer12. COPD-verergering bevordert de sterfte van patiënten, vermindert de kwaliteit van leven en verhoogt de economische lasten voor de samenleving13.
De luchtwegen luchtweg is een open systeem, voortdurend onderworpen aan verschillende microbiële pathogenen die extern aanwezig zijn. Opportunistische bacteriële pathogenen worden meestal gedetecteerd in de bovenste luchtwegen, maar soms worden waargenomen in de onderste luchtwegen14,15. In diermodellen kan P. aeruginosa worden gedetecteerd in alveololatorzakjes zodra 1 uur na infectie16. Als een belangrijk afweermechanisme, immuuncellen zoals macrofagen of neutrofielen elimineren de bacteriën in de luchtwegen. Longepeppitheelcellen, als de eerste fysiologische barrière, vervullen een unieke rol in de gastheerverdediging tegen microbiële infecties. Longepeppitheelcellen kunnen microbiële invasie, kolonisatie of replicatie reguleren onafhankelijk van immuuncellen17. Sommige moleculen gevonden in epitheliale cellen, waaronder PPARg, oefenen antibacteriële functies uit, waardoor bacteriële kolonisatie en replicatie in longepitheelcellen18reguleren. Het roken van sigaretten kan de moleculen veranderen en de normale afweerfunctie in longepitheelcellen19,20aantasten. Recente studies rapporteerden directe blootstelling van sigarettenrook aan longepepelleiële cellen met behulp van robotrookapparatuur21,22. Blootstelling aan rook kan echter op andere manieren worden uitgevoerd, waaronder de toepassing van CSE. Bereiding van CSE is een reproduceerbare benadering met mogelijke toepassingen in andere celtypen, waaronder vasculaire endotheelcellen die indirect worden blootgesteld aan sigarettenrook.
Dit rapport beschrijft een protocol om sigarettenrook extract te genereren om bacteriële belasting in longepelliële cellen te veranderen. CSE verhoogt de bacteriële belasting van P. aeruginosa, en het kan bijdragen aan de herhaling van bacteriële infecties meestal gezien in COPD verergering. Voor de bereiding van CSE wordt een conventionele methode gebruikt. Longepeppitheelcellen, in hun exponentiële groeistadium, worden behandeld met 4% CSE voor 3 uur. Als alternatief kunnen monolaag-gekweekte longepelleliale cellen direct worden blootgesteld aan sigarettenrook in een lucht-vloeibare interface. CSE-behandelde cellen worden vervolgens uitgedaagd met Pseudomonas bij een veelheid van infectie (MOI) van 10. De bacteriën worden gepropageerd met een bepaalde schudsnelheid om ervoor te zorgen dat de morfologie van hun flagella intact blijft om hun volledige invasieve capaciteit te behouden. Gentamycine wordt gebruikt om de bacteriën te doden die in het kweekmedium achterblijven, waardoor de potentiële besmetting tijdens de daaropvolgende bepaling van de bacteriële belasting wordt verminderd. Het protocol maakt ook gebruik van GFP-gelabelde Pseudomonas, die is gebruikt als een krachtig instrument bij het bestuderen van Pseudomonas infectie in verschillende modellen. Een representatieve stam is P. fluorescens Migula23. De mate van infectie of bacteriële belasting na de CSE-behandeling wordt op drie manieren bepaald: de druppelplaatmethode met kolonietelling, kwantitatieve PCR met Pseudomonas 16S rRNA-specifieke primers, of flow cytometrie in cellen die besmet zijn met fluorescerende Pseudomonas. Dit protocol is een eenvoudige en reproduceerbare benadering om het effect van sigarettenrook op bacteriële infecties in longepeleliële cellen te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacteriële invasie in longepelleiële cellen is een cruciale stap in de pathogenese van bacteriële infecties. Het proces van bacteriële invasie in de cellen kan worden opgesplitst in de volgende drie stappen: Ten eerste, de bacteriën contact en hechten zich aan het oppervlak van de epitheelcel met behulp van hun flagella. Ten tweede ondergaan de bacteriën ofwel internalisatie of dringen het cellulaire membraan binnen. Ten slotte repliceren en koloniseren de bacteriën de cellen als ze met succes ontsnappen aan cellu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een National Institutes of Health R01 subsidies HL125435 en HL142997 (aan CZ).
Materials
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
