دراسة آثار دخان السجائر على عدوى Pseudomonas في الخلايا الظهارية الرئة
Summary
وصف هنا هو بروتوكول لدراسة كيفية استخراج دخان السجائر يؤثر على الاستعمار البكتيري في خلايا الظهارية الرئة.
Abstract
تدخين السجائر هو السبب الرئيسي المسببة لنفاخ الرئة ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). كما أن تدخين السجائر يعزز قابلية الإصابة بعدوى بكتيرية في الجهاز التنفسي. ومع ذلك، فإن آثار تدخين السجائر على العدوى البكتيرية في الخلايا الظهارية الرئة البشرية لم تدرس بعد بدقة. ويرد هنا هو بروتوكول مفصل لإعداد مقتطفات تدخين السجائر (CSE)، وعلاج الخلايا الظهارية الرئة البشرية مع CSE، والعدوى البكتيرية وتحديد العدوى. تم إعداد CSE مع طريقة تقليدية. تم علاج الخلايا الظهارية الرئة مع 4٪ CSE ل 3 ح الخلايا المعالجة CSE كانت، ثم، مصابة Pseudomonas في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10. تم تحديد الأحمال البكتيرية من الخلايا من خلال ثلاث طرق مختلفة. وأظهرت النتائج أن CSE زيادة تحميل Pseudomonas في خلايا الرئة الظهارية. لذلك، يوفر هذا البروتوكول منهجًا بسيطًا ويمكن إعادة إنتاجه لدراسة تأثير دخان السجائر على العدوى البكتيرية في خلايا الرئة الظهارية.
Introduction
يؤثر تدخين السجائر على الصحة العامة لملايين الناس في جميع أنحاء العالم. العديد من الأمراض الضارة, بما في ذلك سرطان الرئة ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD), ويقال أن تكون ذات صلة لتدخين السجائر1,2. التدخين السجائر يزيد من التعرض للعدوى الميكروبية الحادة في الجهاز التنفسي3,4,5. وعلاوة على ذلك، تثبت الأدلة المتزايدة أن تدخين السجائر يعزز التسبب في العديد من الاضطرابات المزمنة6،7،8. على سبيل المثال، قد يزيد تدخين السجائر من العدوى الفيروسية أو البكتيرية التي تسبب تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد9. من بين مسببات الأمراض البكتيرية التي تساهم في تفاقم حاد مرض الانسداد الرئوي الحاد ، وهو عامل أمراض عصيات سلبية الغرام ، Pseudomonas aeruginosa، يسبب العدوى التي ترتبط مع سوء التكهن وارتفاع الوفيات10،11. تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد يزيد من تفاقم المرض عن طريق تسريع التقدم المرضي. لا توجد علاجات فعالة ضد تفاقم الانسداد الرئوي الحاد باستثناء إدارة12مضاداً للأعراض . إن تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد (COPD) يعزز وفيات المرضى، ويقلل من نوعية الحياة، ويزيد من العبء الاقتصادي على المجتمع13.
مجرى الهواء التنفسي هو نظام مفتوح ، يخضع باستمرار لمختلف مسببات الأمراض الميكروبية الموجودة خارجيا. وعادة ما يتم الكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية الانتهازية في الشعب الهوائية العليا ولكن في بعض الأحيان لوحظ في الشعب الهوائية السفلية14,15. في نماذج الحيوان P. aeruginosa يمكن الكشف عنها في الحويصلات السنخية في أقرب وقت 1 ح بعد العدوى16. كآلية دفاعية رئيسية، الخلايا المناعية مثل الضامة أو العدلات القضاء على البكتيريا في الشعب الهوائية. الخلايا الظهارية في الرئة، باعتبارها الحاجز الفسيولوجي الأول، تؤدي دورا فريدا في الدفاع المضيف ضد الالتهابات الميكروبية. قد تنظم الخلايا الظهارية للرئة الغزو الميكروبي، أو الاستعمار، أو النسخ المتماثل المستقل للخلايا المناعية17. بعض الجزيئات الموجودة في الخلايا الظهارية، بما في ذلك PPARg، ممارسة وظائف مضادة للبكتيريا، وبالتالي تنظيم الاستعمار البكتيري وتكرار في خلايا الظهارية الرئة18. قد تدخين السجائر تغيير الجزيئات وضعف وظيفة الدفاع الطبيعي في خلايا الظهارية الرئة19,20. وأفادت الدراسات الحديثة التعرض المباشر لدخان السجائر لخلايا الرئة الظهارية باستخدام جهاز التدخين الروبوت21,22. ويمكن إجراء التعرض للدخان بطرق أخرى، ومع ذلك، بما في ذلك تطبيق CSE. يعد إعداد CSE نهجًا قابلًا للتكرار مع التطبيقات المحتملة في أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الخلايا البطانية الوعائية التي تتعرض بشكل غير مباشر لدخان السجائر.
يصف هذا التقرير بروتوكولًا لتوليد مستخلص دخان السجائر لتغيير الحمل البكتيري في الخلايا الظهارية في الرئة. CSE يزيد من الحمل البكتيري P. aeruginosa، وأنه قد يسهم في تكرار الالتهابات البكتيرية عادة ما ينظر في تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد. يتم استخدام طريقة تقليدية لإعداد CSE. خلايا ظهارية الرئة، في مرحلة النمو الأسي، يتم التعامل مع 4٪ CSE لمدة 3 ساعة. بدلا من ذلك، يمكن أن تتعرض الخلايا الظهارية لمعالجة الرئة أحادية الطبقات مباشرة لدخان السجائر في واجهة الهواء السائل. ثم يتم تحدي الخلايا المعالجة CSE مع Pseudomonas في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10. يتم نشر البكتيريا بسرعة اهتزاز خاصة لضمان مورفولوجيا فلايديلا الخاصة بهم لا تزال سليمة للحفاظ على قدرتها الغازية الكاملة. يتم استخدام جينتاميسين لقتل البكتيريا التي تركت في الوسط الثقافة، وبالتالي الحد من التلوث المحتمل خلال تحديد لاحق من الحمل البكتيري. كما يستخدم البروتوكول Pseudomonasالمسمى GFP ، والتي تم استخدامها كأداة قوية في دراسة العدوى Pseudomonas في نماذج مختلفة. سلالة ممثل هو P. الفلوريسينS Migula23. يتم تحديد درجة العدوى أو الحمل البكتيري بعد العلاج CSE في ثلاث طرق: طريقة لوحة قطرة مع عد مستعمرة، PCR الكمية باستخدام Pseudomonas 16S RRNA التمهيدي محددة، أو تدفق الخلايا في الخلايا المصابة ب Pseudomonasالفلورسنت . هذا البروتوكول هو نهج بسيط ويمكن استنساخه لدراسة تأثير دخان السجائر على العدوى البكتيرية في خلايا الرئة الظهارية.
Protocol
Representative Results
Discussion
غزو البكتيريا في خلايا الظهارية الرئة هو خطوة حاسمة في التسبب في الالتهابات البكتيرية. يمكن تقسيم عملية الغزو البكتيري إلى الخلايا إلى الخطوات الثلاث التالية: أولاً ، تتصل البكتيريا وتلتزم بسطح الخلية الظهارية باستخدام flagella الخاصة بهم. ثانياً، تخضع البكتيريا إما إلى الداخل أو تخترق الغش…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 منح HL125435 و HL142997 (إلى CZ).
Materials
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
