JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Akustik Ayırıcı Kullanarak CHO Hasat Edilen Hücre Kültürü Sıvısının Birincil Netleştirilmesi

Published: May 14, 2020
doi:
10.3791/61161
, , ,
1Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II,U.S. Food and Drug Administration

Summary

Burada sunulan, akustik ayırıcı kullanılarak CHO hücre kültürünün birincil netleştirilmesi için bir protokoldür. Bu protokol, sallama şişesi kültürlerinin veya biyoreaktör hasatlarının birincil netleştirilmesi için kullanılabilir ve perfüzyon biyoreaktör işlemleri sırasında hücre kanaması malzemesinin sürekli olarak açıklığa kavuşması için potansiyel bir uygulamaya sahiptir.

Abstract

Birincil açıklama, hasat edilen hücre kültürü sıvısı içindeki terapötik ürünlerden hücrelerin ilk çıkarılması için biyo-üretim sürecinde önemli bir adımdır. Hücrenin çıkarılması için santrifüjleme veya filtrasyon gibi geleneksel yöntemler yaygın olarak uygulanırken, bu prosesler için ekipman büyük ayak izlerine sahiptir ve çalışma kontaminasyon riskleri ve filtre kirlenmesi içerebilir. Ayrıca, geleneksel yöntemler birincil açıklama için sürekli biyoişlem şemaları için ideal olmayabilir. Böylece hücreleri hücre kültürü sıvısından sürekli ayırmak için akustik (ses) dalgaları kullanan alternatif bir uygulama araştırılmıştır. Bu çalışmada, bir CHO hücre biyoreaktör hasadından monoklonal IgG1 antikoru içeren kültür sıvısının birincil ayrımı için tezgah ölçeğinde akustik dalga ayırıcı (AWS) kullanmak için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Temsili veriler AWS’den sunulur ve etkili hücre açıklaması ve ürün kurtarmanın nasıl elde edildiğini gösterir. Son olarak, aws için sürekli biyoişlemdeki potansiyel uygulamalar tartışılmaktadır. Genel olarak, bu çalışma CHO hücre kültürleri için birincil açıklama aws uygulaması için pratik ve genel bir protokol sağlar ve sürekli biyoişlemde uygulama potansiyelini daha ayrıntılı olarak açıklar.

Introduction

Salgılanan terapötik proteinleri içeren bir biyo-üretim sürecinde kritik bir adım, biyokütlenin hasat edilen hücre kültürü sıvısından (HCCF) uzaklaştırılmasıdır. Geleneksel olarak, biyomüstrüktürerler monoklonal antikorların üretiminde birincil açıklama yöntemleri olarak santrifüjasyonu ve ardından derinlik filtrasyonunu benimsemiştir1. Bununla birlikte, santrifüjleme hücreler üzerinde yüksek kesme stresine yol açabilir ve bu da HCCF’de hücresel kalıntıların artmasına neden olabilir. Bu potansiyel olarak filtrasyon sırasında filtre kirlenmesine yol açabilir ve daha sonra aşağı akış kromatografi verimliliğini1,2,3azaltabilecek ekstra kirletici postfiltrasyona neden olabilir. Ayrıca, santrifüjlerin belirli bir işlem için özelleştirilmesi maliyetli olabilir ve yerinde temizleme ve yerinde sterilize etme sistemlerine ek bağlantılar gerektirebilir ve bu da ölçeklenebilirlik için sınırlayıcı bir faktör olabilir. Derinlik filtrelerinin kullanımı santrifüjlemenin sınırlamalarını telafi edebilir ve ayrıca tek kullanımlık teknolojiden yararlanabilir4. Ancak, derinlik filtreleri öncelikle ikincil açıklama olarak kullanılır, çünkü yüksek hücre kültürü yoğunluklarına dayanamazlar5. Alternatif olarak, kesme stresini azaltmak için teğetsel akış filtrasyonu (TFF) hücre tutma cihazları kullanıldı, ancak membran polarizasyonu ve zayıf hasat verimi gibi zorluklarla karşılaşabilirsiniz6. Santrifüjleme artı derinlik filtrasyonu veya TFF kullanımından kaynaklanan yukarıdaki konular, HCCF’nin birincil açıklama sürecinin iyileştirilmesi için bir fırsat yaratmaktadır.

Akustik ayırma, hücre kültürlerinden salgılanan proteinlerin yüksek kaliteli protein ürünleri ile toplanmasında kullanılabilecek bir teknoloji olarak tanıtıldı7,8. Akustik ayırma, askıya alınmış sıvılar ve tutulan parçacıklarla etkileşime giren çok boyutlu duran dalgaların yayılması ve yansıması ile elde edilir9,10. Bu parçacıklar üç kuvvet yaşar: sıvı sürükleme, yerçekimi ve akustik radyasyon. Kuvvetlerin her biri birbirine eşit derecede karşı olduğunda, dengeye ulaştığında, parçacıklar askıya alınır ve ultrasonik duran dalga10içinde sıkışır. Bir hücre kültürü süspansiyonunda, hücreler ayakta duran dalgaların bu basınç düğümü düzleminde tutulur, hücreler birleştikçe düğüm büyür ve sonunda bu hücresel düğüm kümeleri yerçekimsel kuvvet9’dandüşer. Bu tortulu hücreler daha sonra ortamdan çıkarılır, bu da netleştirilmiş ortamın daha fazla aşağı akış işlemi için pompalanmasına izin verir. Ultrasonik dalgaların bir ayırma yöntemi olarak kullanılması, lipit parçacıklarının ve kırmızı kan hücrelerinin ayrılmasından11’e memeli perfüzyon hücre kültürüne kadar biyolojik uygulamalara çevrilmeye başlamıştır12. Santrifüjleme, derinlik filtrasyonu veya TFF’den kaçınarak maliyetleri, işçiliği ve hücresel stresi azaltmaya yönelik göreceli yetenekleriyle biyomüstrüktürerler akustik ayırma kullanmanın potansiyel uygulamalarını araştırıyor.

Bu çalışma, CHO hücre kültürünün netleştirilmesi için tezgah üstü akustik dalga ayırıcısını (AWS) işletmek için genel bir protokol sağlar, temsili veriler sunar ve etkili hücre açıklaması ve ürün kurtarmanın nasıl eldeılacağını gösterir.

Protocol

1. AWS’nin Hazırlanması NOT: Bu protokol bir acoustophoretic odası kullanılarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, tezgah ölçeğindeki AWS, gerekirse seri olarak 4 acoustophoretic odası çalıştırabilen beş bulanıklık probuna sahiptir. Bulanıklık kablolarını F, 1, 2, 3, 4 (örneğin, Şekil 1c’deki bulanıklık probu 1 ve Şekil 2a’dakibağlantı noktası 1) olarak etiketlenmiş ilgili bağlantı noktalarına ve 1, 2, 3, 4 (Şekil 2b)olarak etiketlenmiş AWS sisteminin arkasına oda gücü BNC kablolarına bağlayın.NOT: Odanın diğer ucunun BNC kablosunu (Şekil 3c) acoustophoretic odasının arkasına (Şekil 3d) oda sıvı ile dolduğunda adım 2.6’ya kadar bağlamayın. Oda gücü haznede sıvı olmadan açılırsa, haznedeki piezo dönüştürücüye zarar verir ve artık çalışmaz. Bulanıklık problarını bulanıklık ölçer ve termometre muhafazasına yerleştirin ve vidaları sıkın (Şekil 1c ve Şekil 3). Besleme borularını besleme pompası(Şekil 1b ila1c)aracılığıyla besleme bulanıklık portunun girişine (Şekil4a)bağlayın. Y boruyu besleme bulanıklık portunun çıkışından (Şekil 4b) acoustophoretic odasının giriş portlarına bağlayın (Şekil 4c). Sahne1 boruyu acoustophoretic odasının atık portundan(Şekil 4d)stage1 pompası aracılığıyla bir hücre toplama kabına bağlayın(Şekil 1d’den 1e ila 1f). Boruyu acoustophoretic odasının geçirgen portundan (Şekil 4e) prob1 bulanıklık portunun girişine bağlayın (Şekil 4f). Hasat borularını probun dışından bir ürün toplama kabına(Şekil 1c ila1g)bağlayın1 bulanıklık portu (Şekil 4g). 2. Sistemi HCCF ile astarla NOT: Bu protokol, IgG1 monoklonal antikor VRC0113 modelini üreten kimyasal tanımlı ortamda (6 mM L-glutaminli ActiCHO P) kültürlenen CHO-K1 hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir ve diğer hücre hatları ve ürünleri için ayarlanması gerekebilir. Bu protokolde kullanılan HCCF, 7-8 günlük CHO-K1 kültürlerinin sonunda bir sallama şişesi veya biyoreaktör işleminden elde edildi. AWS’nin arka ve ön taraftaki güç anahtarlarını açarak AWS’yi açın. Bilgisayarı açın ve ilişkili yazılımın masa simgesini çift tıklatın (bkz. Malzeme Tablosu). “Okumalar” panelinden, veri kaydını başlatmak için “Testi Başlat” düğmesine basın (Şekil 5). Veri kaydı başlatıldıktan sonra, toplanan tüm veriler test durdurulana kadar dışa aktarılabilir bir elektronik tabloya kaydedilir. Besleme boru ucunu karıştırılan HCCF kabına bağlayın. ” Besleme Pompası Görüntüsü ” içindeki “Kontroller” ekranında pompa oranını girerekbesleme pompasınıbaşlatın ve klavyede “Enter” tuşuna basın. HCCF’yi kaptan acoustophoretic haznesine pompalamak için Besleme Pompası Görüntüsünün sağındaki gri kutuda ” PompaYönü Ok Simgesi” nin (saat yönünde veya saat yönünün tersine) doğru şekilde seçildiğinden emin olun. Pompayı başlatmak için Besleme Pompası Görüntüsü altındaki gri kutunun içindeki “AÇ” kelimelerinin yanındaki”Üçgen Simgesi” ne tıklayın ( Şekil6a).NOT: Maksimum pompa oranı 10 L/h ‘dir (167 mL/dk), ancak bu adım için 60 mL/dk nominal akış hızının, ayırmaya başlamadan önce hazneyi aşırı doldurma riski olmadan boruyu ve hazneyi hızlı bir şekilde doldurması önerilir. Acoustophoretic odasının doldurulması sırasında “Yüzde Azaltma Paneli” ni ( Şekil5c) gözlemleyerek yem bulanıklığı ölçümlerini izleyin. HCCF gemisinde yeterince karıştırılıyorsa, haznenin yüklenmesi sırasında bulanıklık değerleri tutarlı kalacaktır. Sıvı, acoustophoretic haznesinin arkadaki piezo dönüştürücünün üzerine çıktıktan sonra, pompayı durdurmak için Besleme Pompası Görüntüsü altındaki gri kutunun içindeki “KAPAT” tuşuna basın. BNC güç kablosunu (Şekil 3c) acoustophoretic chamber’a bağlayın (Şekil 3d).NOT: Her acoustophoretic odasının bekleme hacmi yaklaşık 190 mL’dir. 3. AWS’nin işleyişi Acoustophoretic odası doldurulduktan ve BNC güç kablosu acoustophoretic odasının arkasına bağlandıktan sonra, besleme pompası oranını istenen çalışma hızına değiştirin(Şekil 6a ve Tablo 1). Belirli bir proses için ideal çalışma parametrelerini belirlemek için çeşitli besleme pompası oranları test edilmelidir. Güç modülündeki çubuğu 10 W’a (Şekil 6d)kaydırarak ve Sahne Alanı 1 kutusunun sağ tarafındaki “AÇ” simgesine basarak sahne1 piezo gücünü açın (Şekil 6c). Üretici tarafından önerildiği gibi, CHO hücreleri için önerilen güç ayarı olan 10 W’ı kullanın. Bu, çalışma için 2 MHz sabit bir frekans oluşturacaktır. Birkaç saniye sonra, hücreler acoustophoretic odasındaki dalga düğümlerinde gözle görülür bir şekilde topaklanmaya başlayacaktır (Şekil 7a). Hücreler acoustophoretic odasının dibine yerleşmeye başladıktan sonra (Şekil 7b), hücre yoğunluğuna ve besleme pompası oranına göre uygun bir oran ile stage1 pompasına başlayın (Şekil 6b). Üreticinin optimizasyonuna ve sabit durumlu çalışma elektronik tablosuna dayanarak, stage1 pompa oranı aşağıdaki denklem kullanılarak paketlenmiş hücre kütlesi ve ilerleme akış hızına göre hesaplanabilir Paketlenmiş hücre kütlesini hesaplamak için, boş bir 15 mL tüp (veya santrifüjleme ile uyumlu başka bir tüp) ile bir ölçek daralayın. Tüpü yem malzemesi ile doldurun ve tüpün toplam ağırlığını yemle kaydedin. Tüpü 3.700 x g’da 10 dakika santrifüj edin. Süpernatantı ayrı bir kaba ayırın. Hücre pelet ile tüpün ağırlığını ölçün. Besleme malzemesinin paketlenmiş hücre kütlesi yüzdesi = (dekante tüp ağırlığı/ dolu tüp ağırlığı) x% 100. Acoustophoretic odasından taşma bulanıklık probuna girerken stage1 bulanıklığının bulanıklık profilini izleyin1 (Şekil 8). Hücre ayrımı devam ettikçe hücre çıkarma verimliliği artacaktır. Ayrıca, hücre ayrımı devam ettikçe artacağı için yem ve aşama1 arasındaki sıcaklık farkını izleyin (Şekil 9). Daha yüksek hücre yoğunluğunda besleme kullanıldığında sıcaklık artabilir, ancak genellikle ilerleme akış hızı değiştirilerek azaltılabilir.NOT: Birden fazla acoustophoretic odası kullanırken, bulanıklık probları aracılığıyla önceki acoustophoretic odasındaki boruyu mevcut acoustophoretic odasının girişine sırayla bağlayabilirsiniz. Ek olarak, sahne pompaları aracılığıyla acoustophoretic odalarının dibinden hücre toplama kaplarına sahne borularını bağlayabilirsiniz. Gerekirse optimum hücre çıkarma verimliliği için toplam dört acoustophoretic odası seri olarak bağlanabilir. 4. AWS’nin Son Çalışma bittiğinde, pompaları durdurmak için sırasıyla besleme pompasının altındaki gri kutu ve stage1 pompa görüntülerinin içindeki KAPAT’a basarak beslemeyi ve stage1 pompasını durdurun. Sahne Alanı 1 kutusunun sağ tarafındaki KAPAYIn tuşuna basarak odanın gücünü kapatın ve BNC güç kablosunu çıkarın. Derinlik filtrasyonu ve kromatografi yöntemleri gibi daha fazla açıklama ve saflaştırma prosedürleri için toplanan ürün hasat malzemesini alın. Hücre hasat malzemesini atın. Atık boruyu boş bir kap içine yerleştirerek, boruyu acoustophoretic hazne girişinden ve geçirgen bağlantı noktalarından ayırarak ve atık boruyu pompa kafasından serbest bırakarak, akoustophoretic odasında kalan sıvıyı boşaltın. Boruyu yeniden bağlayın, atık boruyu pompa kafasına geri yerleştirin ve 60 mL/dk besleme pompası oranı ve 60 mL/dk stage1 pompa oranı kullanarak besleme tüpünün sonundan DI suyundan akar. 15-20 dk devam edin. Akışı atın. 15-20 dakika boyunca besleme pompasını kullanarak borudan ve hazneden % 70 izopropil alkol (IPA) pompalayın. Akışı atın. Besleme pompasını 15-20 dakika kullanarak tüpleri ve hazneyi temizlemek için DI suyu ile temizleme prosedürünü tekrarlayın. Akışı atın. Boruyu bulanıklık problarından ve acoustophoretic odalarından sökün ve bölgeyi% 70 IPA ile temizleyin. Bulanıklık problarını sökün ve bulanıklık problarının içini % 70 IPA ile temizleyin. Tüm parçaların kurumasına izin verin ve bir sonraki kullanım için yeniden bir araya gelin.NOT: Acoustophoretic hazneleri tek kullanımlık olarak üretilmiştir, ancak bu protokolde açıklandığı gibi düzgün bir şekilde ele alınır ve temizlenirse yeniden kullanılabilir.

Representative Results

Protokolde açıklandığı gibi AWS, Şekil1’de gösterildiği gibi HCCF’yi 12,4 x10 6 hücre/mL yoğunluğunda netleştirmek için kullanılmıştır. Besleme pompası 3,5 mL/dk (5 L/gün) olarak ayarlanmıştır ve 10-20 L kültürü için uygun olduğu varsayılan aralıkta bir hücre kanaması oranını temsil eder. HCCF AWS odasına girerken, besleme bulanıklığı probundan gelen bulanıklık ölçümleri tutarlı kaldı, yaklaşık 1.000-1.100 NTU ve prob1 bulanıklık probundan ölçümler 40-50 NTU civarında kaldı (Şekil 8). İki ölçümü kullanarak hücre kaldırma verimliliği hesaplandı ve ortalaması olarak ölçülerek gerçekleşti. 40-50 NTU bulanıklık ölçümünün elde edilebilen minimum bulanıklık seviyesi olduğu ve bu nedenle seri olarak ek bir AWS odasından daha fazla ayrılmanın mümkün olmadığı bulunmuştur. AWS daha düşük akış hızlarında yüksek verimlilikle ayrılabilirken, HCCF’yi oda içinde daha uzun süre tutmak sıcaklık artışlarına neden oldu ve bu da daha düşük akış hızlarını seçerken dikkate alınması gereken bir durumdur. Şekil 9, akoustophoretic odasına girmeden önce ve akustik bölme içinde uzun süre nedeniyle sıcaklıkta >6 ° C’lik bir artış gösteren 3,5 mL / dk’lık bir besleme akış hızında akustik ayırmadan sonra HCCF’nin sıcaklık farkının bir örneğidir. Yüksek hücre yoğunluğunda hasatlar yapılırken bir diğer önemli husus (yani, >20 x 106 hücre/mL) bulanıklık problarının doygunluğudur. Yem bulanıklığı probu için bulanıklık ölçümleri 4.400 NTU(Şekil 10)üzerinde doygun hale geldi ve bu da hücre çıkarma verimliliğinin hesaplanmasında hafife alınmasına neden olabilir. Farklı ilerleme hızlarının hücre açıklaması üzerindeki etkisini test etmek için hücre çıkarma verimliliği farklı ilerleme hızlarında ölçüldü. Şekil 11’degösterildiği gibi, besleme pompası oranı arttıkça hücre kaldırma verimliliği ~% 100’den% 57’ye önemli ölçüde azaldı. Genel olarak, besleme pompası hızı ne kadar yavaş olursa, hücre açıklaması o kadar iyi olur. Ancak, her uygulama için ilerleme hızının optimizasyonu önerilir. Şekil 1: AWS Kurulumu. Pompalar yazılımla (a) açıldıktan sonra, HCCF bir besleme pompası (b) aracılığıyla besleme bulanıklığı sondası (c) aracılığıyla daha sonra AWS odasına (d) kanalize edildi. Odanın içinde, akustik kuvvetler dalgaların düğümlerindeki akıştan hücreleri hapsetti ve topaklamalara neden oldu. Azaltılmış yüzdürme, hücrelerin yerçekimsel kuvvetten düşmesine neden oldu ve hücreler acoustophoretic odasının atık portundan stage1 pompası (e) aracılığıyla bir hücre hasat şişesine (f) çıkarılırken, netleştirilmiş malzeme haznenin geçirgen bağlantı noktasından bir ürün hasat şişesine (g) sonda1 bulanıklık probuna (c) çıktı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: AWS sisteminin arkası. Bulanıklık probları ve odaları, bulanıklık probu ethernet(a ) ve oda gücü BNC (b) kabloları aracılığıyla AWS sisteminin arkasındaki ilgili bağlantı noktalarına bağlanır. Ayrıca, bilgisayar PC ethernet kablosu (c) ile bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Bulanıklık probları ve muhafazası. Her bulanıklık probu (a) ilgili bulanıklık ölçere ve termometre muhafazasına (b) uygun şekilde yerleştirilmeli ve vidalarla sıkılmalıdır. Oda gücü BNC kablosu (c) sadece odadaki piezo dönüştürücü sıvı ile doldurulduktan sonra acoustophoretic odasının arkasına (d) bağlanmalıdır. Problar aşağıdaki gibi belirtilir: F = besleme bulanıklığı, 1 = prob1 bulanıklık ve 2, 3 ve 4 kullanılmayan problardır (veya prosedürü seri hale getirmek için kullanılabilir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Bulanıklık muhafazası ile acoustophoretic odası arasındaki bağlantı. Besleme tüpü, besleme pompası aracılığıyla yem bulanıklık portunun(a)girişine bağlanır. Besleme bulanıklık portunun çıkışı (b) y-tubing ile acoustophoretic chamber(c)giriş portlarına bağlanır. Stage1 boru, acoustophoretic odasının(d)atık portundan stage1 pompası aracılığıyla bir hücre toplama kabına bağlanır. Acoustophoretic odasının geçirgen bağlantı noktası (e) prob1 bulanıklık portunun (f) girişine bağlıdır. Hasat tüpü prob1 bulanıklık portunun (g) dışından bir ürün toplama kabına bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Akustik Ayırıcı yazılımındaki okumalar paneli. Programın “Okumalar” ve “Kontroller” olmak üzere iki paneli vardır. “Okumalar” panelinde bulanıklık (a), sıcaklık (b) ve yüzde azaltma (c) izlenir. Veri kaydını başlatmak için, düğmenin rengini yeşil olarak değiştirecek olan “Testi Başlat” düğmesinin(d)tıklatılması gerekir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Programdaki kontroller paneli. “Kontroller” panelinde pompalar açılabilir veya kapatılabilir ve pompalama oranı besleme (a) ve diğer aşamalar (b) için değiştirilebilir. Ayrıca, piezo dönüştürücüser üzerindeki oda gücü açılabilir veya kapatılabilir (c) ve bir slayt çubuğu (d) ile değiştirilebilir. Deneylerde 10 W kullanıldı, çünkü üretici tarafından önerildiği gibi CHO hücreleri için önerilen güç ayarıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: AWS Chamber. Hücreler odanın içine girdikten sonra, akustik kuvvetler hücreleri dalgaların düğümlerine hapsetti ve hücrelerin kümelenmesine neden oldu (a). Bu hücre kümelerinin yüzdürme gücü kaybolana kadar boyutları arttı ve sonunda yerçekimsel kuvvetle yerleştiler (b). Daha sonra, yerleştirilen hücreler, sahne1 pompası aracılığıyla aforoforetik odanın atık portundan bir hücre hasat şişesine (c) çıkarıldı. Ürün, permeat portu (d) üzerinden odadan çıkarken, HCCF sürekli olarak giriş portları (e) üzerinden hazneyi doldurdu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: 3,5 mL/dk besleme pompası oranına sahip 12 x10 6 hücre/mL CHO hücre kültürü için bulanıklık ölçümleri. Yem bulanıklığı (mavi) yaklaşık 1.000 NTU ve evre 1 bulanıklık ölçerden (turuncu) çıkan geçirgenlik 40-60 NTU idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: 3,5 mL/dk besleme pompası oranına sahip 12 x10 6 hücre/mL CHO hücre kültürü için sıcaklık ölçümleri. Yem sıcaklığı (mavi) yaklaşık 21 °C idi ve aşama 1 bulanıklık ölçerden (turuncu) çıkan geçirgenlik yaklaşık 27 °C idi. Şekil 10: Yüksek hücre yoğunluğu örneği için bulanıklık ölçüm örneği. Hücre yoğunluğu 20 x 106 hücre/mL > olduğunda, yem bulanıklığı ölçümü maksimum 4.400 NTU değerinde doyuruldu ve bu da hücre çıkarma verimliliğinin hafife alınmasına neden oldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 11: Hücre kaldırma verimliliği karşılaştırması. Besleme hızı arttıkça hücre ayrımı da azaldı. Bu nedenle, ilerleme hızı arttıkça, hücre açıklama verimliliği azaldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Parametre Şartname Akış Hızı 0 – 10 L/h Basınç Aralığı 0 – 2 bar (0 – 30 psi) Yem Sıvısı Sıcaklığı 0 – 40 °C (32 – 104 °F) Çalışma Sıcaklığı 0 – 40 °C (32 – 104 °F) Tablo 1: Çalışma Koşulları. Akış hızı, basınç aralığı, besleme sıvısı ve çalışma sıcaklığı için AWS üreticisinden önerilen çalışma koşulları.

Discussion

Açıklanan, bir CHO hücre hattının HCCF’sinden model monoklonal antikorun birincil netleştirilmesinde tezgah ölçeğinde bir AWS’nin uygulanması için adım adım bir protokoldür. Temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, AWS’nin birincil açıklama içinde kullanılması etkili hücre açıklaması ve ürün kurtarma ile sonuçlandı. Ayrıca, düşük bakım ve operasyonel gereksinimler seviyesi ve ölçek büyütme yeteneği, birincil açıklamalarda daha geniş uygulama potansiyeli sağlar.

Daha da önemlisi, temsili sonuçlar, besleme pompası oranının hücrelerin ayrılması için kritik olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, bulanıklık ölçümünde yüksek hücre yoğunluğunu tespit etmedeki sınırlamalar nedeniyle, çalışan hücre yoğunluğu bir AWS sistemi kullanırken göz önünde bulundurulması gereken bir başka faktördür. Bulanıklık probu yüksek hücre yoğunluklu besleme malzemesi çalıştırırken doygun olacağından, besleme malzemesinin hücre yoğunluklarını ve netleştirilmiş hücre kültürü sıvısını çevrimdışı ölçerek hücre ayırma verimliliğini hesaplamak en iyisi olabilir. Açıklamanın doğru çevrimdışı ölçümü ile, bu sorunların çözümünde düşünülebilecek bir süreç stratejisi, seri olarak birden fazla oda kullanmaktır. Bu protokol öncelikle tek bir odacık kullanmaya odaklansa da, bu sistem hücrelerin durumunu en az etkileyebilecek ve yüksek ürün geri kazanımı ile sonuçlanabilecek hücrelerin sıralı olarak açıklığa kavuşması için üç ek oda çalıştırabilir. Ayrıca, AWS için güç ve hücre kaldırma akış hızları gibi diğer parametreler de belirli hücre türleri veya çalışma modu için optimize edilebilir. Genel olarak, AWS’nin uygulanmasından önce bu hususları kullanarak operasyon parametrelerinin ve stratejisinin optimizasyonu önerilir.

Birçok uygulama potansiyeli arasında AWS’nin sürekli biyoişlemde kullanılması umut vericidir. AWS santrifüjlemenin yerini alabildiğinden ve filtre yüzey alanı14’übüyük ölçüde azaltabildiğinden, AWS’nin kullanımı, sürekli biyo-üretimle uyumlu sonraki filtrasyon ve kromatografi işlemleri için hücresiz malzeme akışını sağlar. Bu uyumluluk ve yüksek hücre yoğunluğu (örneğin, >50 x 106 hücre/mL) ve daha uzun kültür süresi (örneğin, >14 gün) için perfüzyon teknolojisinin kullanılabilirliği nedeniyle AWS, birincil açıklamaya ek olarak yeni bir sürekli hücre kanaması stratejisi geliştirme potansiyeline sahiptir.

Bazı durumlarda, hücre kanaması materyalinde sabit durum çalışması sırasında üretilen protein terapötikinin% 30’una kadar çıkarılır15,16. Ek olarak, çıkarılan monoklonal antikorların standart hasat edilen malzeme ile birleştirilmesi için belirli kalite özelliklerinin karşılanması gerekir. Bu spesifikasyonlar karşılanmadığında, sonuç ürün verimini etkileyebilecek malzemenin reddedilmesi olabilir. Bu tür ürün kaybını telafi etmek için, AWS kullanarak hücre kanaması materyalinin sürekli olarak açıklığa kavuşması, uzun süreli bir perfüzyon işlemi sırasında sabit bir durumda uygulanabilir17. Bu strateji kanama malzemesindeki ürün kaybını azaltabilir ve üretilen proteinin daha fazlasını kullanabilir. Buna ek olarak, AWS kullanılarak sürekli açıklama sonrasındaki hücreler, daha yüksek hücre yoğunluğu ve üretkenlik için istenirse potansiyel olarak biyoreaktöre geri eklenebilir. Bu nedenle, hücre kanaması materyalinin AWS ile sürekli olarak açıklığa kavuşması, belirli bir süreçte verimi artırma ve/veya ikincil filtre yüzey alanını azaltma fırsatı sunabilir.

Özetle, AWS’nin yararı basit birincil açıklamayla sınırlı değildir, ancak sürekli biyoişlemdeki uygulamalar için üretim oranını ve operasyonel esnekliği artırabilecek yardımcı programlara sahip olabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Nilou Sarah Arden ve Zhong Zhao’yu bu makaleyi yapıcı bir şekilde inceledikleri için kabul etmek istiyor. Yazarlar ayrıca Lindsey Brown’a bu proje sırasındaki temel girdileri için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma için kısmi iç finansman ve destek CDER Kritik Yol Programı (CA #1-13) ve CDER İmalat Bilimi, İnovasyon Mükemmeliyet Merkezi Programı (Berilla-CoE-19-49) tarafından sağlanmıştır. Bu proje kısmen, Oak Ridge Bilim ve Eğitim Enstitüsü tarafından ABD Enerji Bakanlığı ve FDA arasında yapılan kurumlar arası bir anlaşma ile yönetilen ABD Gıda ve İlaç İdaresi Biyoteknoloji Ürünleri Ofisi Staj/Araştırma Katılım Programı tarafından desteklenmiştir.

Bu yayın yazarın görüşlerini yansıtır ve FDA’nın görüşlerini veya politikalarını temsil etmek için yorumlanmamalıdır.

Materials

Acoustophorectic chamber Pall CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit
ActiCHO P GE SH31025.01 powder medium
AWS Pall CAS-SYS (60500101-SP)
Cadence Acoustic Separator Software Pall Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4
CHO-K1 cells VRC VRC01
Computer Dell Latitude 3470 Windows 7, 64 bit OS
Isopropanol (70%) LabChem LC157605 20L prepped 70% IPA
L-glutamine Corning 25-005-CV 200 mM stock solution
Masterflex L/S 14 tubing Cole-Parmer 96400-14 peroxide-cured silicone tubing, 25ft
Masterflex L/S 16 tubing Cole-Parmer 96400-16 peroxide-cured silicone tubing, 25ft
Tubing set Pall CAS-FP-K1 Tubing set
Turbidity probe Pall CAS-TS-S1 (60500106)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roush, D. J., Lu, Y. Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology. Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).
  2. Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification. Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).
  3. Shukla, A. A., Suda, E. . Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).
  4. Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology. Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).
  5. Singh, N., et al. Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).
  6. Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).
  7. Ryll, T., et al. Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality. Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).
  8. Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).
  9. Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors. 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).
  10. Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting. The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).
  11. Dutra, B., et al. A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration. Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).
  12. Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. Acoustic perfusion devices. US patent. , (2017).
  13. Wu, X., et al. Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1. Science. 329 (5993), 856-861 (2010).
  14. Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures. Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).
  15. Wolf, M. K. F., et al. Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition. Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).
  16. Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media. Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).
  17. Emily, B., et al. Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling. BioProcess International. 8, 32-39 (2010).

Tags

CHOHarvested Cell Culture FluidAcoustic Wave SeparatorPrimary ClarificationTurbidityCell-freeContinuous BioprocessingFiltrationChromatography

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hong, J. S., Azer, N., Agarabi, C., Fratz-Berilla, E. J. Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator. J. Vis. Exp. (159), e61161, doi:10.3791/61161 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image