Первичное осветление cho Harvested Cell Culture Fluid с помощью акустического сепаратора
Summary
Здесь представлен протокол первичного осветления культуры клеток CHO с использованием акустического сепаратора. Этот протокол может быть использован для первичного осветления культур колбы или урожаев биореакторов и имеет потенциальное применение для непрерывного осветления материала клеточного кровотечения во время перфузионных операций биореактора.
Abstract
Первичное осветление является важным шагом в процессе биопроизводства для первоначального удаления клеток из терапевтических продуктов в собранной жидкости клеточной культуры. В то время как традиционные методы, такие как центрифугирование или фильтрация, широко применяются для удаления клеток, оборудование для этих процессов имеет большие следы, и эксплуатация может включать риски загрязнения и загрязнения фильтра. Кроме того, традиционные методы могут быть не идеальными для схем непрерывной биообработки для первичного осветления. Таким образом, было исследовано альтернативное применение с использованием акустических (звуковых) волн для непрерывного отделения клеток от жидкости клеточной культуры. В этом исследовании представлен подробный протокол использования стендового акустического волнового сепаратора (AWS) для первичного отделения культуральной жидкости, содержащей моноклональное антитело IgG1, от урожая клеточного биореактора CHO. Репрезентативные данные представлены в AWS и демонстрируют, как добиться эффективного осветления ячеек и восстановления продукта. Наконец, обсуждаются потенциальные применения AWS в непрерывной биообработке. В целом, это исследование предоставляет практический и общий протокол для реализации AWS в первичном уточнении для клеточных культур CHO и далее описывает потенциал его применения в непрерывной биообработке.
Introduction
Критическим этапом в процессе биопроизводства с участием секретируемых терапевтических белков является удаление биомассы из собранной клеточной культуральной жидкости (HCCF). Традиционно биопроизводители использовали центрифугирование с последующей глубинной фильтрацией в качестве своих основных методов осветления при производстве моноклональных антител1. Однако центрифугирование может привести к высокой нагрузке сдвига на клетки, что приводит к увеличению клеточного мусора в HCCF. Это может потенциально привести к загрязнению фильтра во время фильтрации и привести к дополнительным загрязнениям после фильтрации, которые впоследствии могут снизить эффективность хроматографии1,2,3. Кроме того, настройка центрифуг для определенного процесса может быть дорогостоящей и может потребовать дополнительных подключений к системам очистки на месте и стерилизации на месте, что также может быть ограничивающим фактором для масштабируемости. Использование глубинных фильтров позволяет компенсировать ограничения центрифугирования, а также воспользоваться преимуществами одноразовой технологии4. Однако глубинные фильтры в основном используются в качестве вторичного осветления, поскольку они не выдерживают высоких плотностей клеточных культур5. В качестве альтернативы, устройства тангенциальной фильтрации потока (TFF) для удержания клеток были использованы для смягчения напряжения сдвига, но могут испытывать такие проблемы, как поляризация мембраны и плохая урожайность6. Вышеуказанные вопросы, возникающие в связи с использованием центрифугирования плюс глубинной фильтрации или TFF, создают возможность для улучшения процесса первичного осветления HCCF.
Акустическая сепарация была введена как технология, которая может быть использована для сбора секретируемых белков из клеточных культур с высококачественными белковымипродуктами7,8. Акустическое разделение достигается за счет распространения и отражения многомерных стоячих волн, которые взаимодействуют с взвешенными жидкостями и удерживаемыми частицами9,10. Эти частицы испытывают три силы: сопротивление жидкости, гравитацию и акустическое излучение. Когда каждая из сил одинаково противостоит друг другу, достигая равновесия, частицы подвешиваются и захватываются внутри ультразвуковой стоячей волны10. В суспензии клеточной культуры клетки удерживаются в этой плоскости узла давления стоячих волн, узел растет по мере слияния клеток, и в конечном итоге эти кластеры клеточных узлов падают от гравитационной силы9. Эти осадочные ячейки затем удаляются из среды, что позволяет откачивать осветленные среды для дальнейшей последующей обработки. Использование ультразвуковых волн в качестве метода разделения начало трансформироваться в биологические приложения, начиная от разделения липидных частиц и эритроцитов11 до перфузионной культуры клеток млекопитающих12. Обладая относительными возможностями по снижению затрат, рабочей силы и клеточного стресса, избегая центрифугирования, глубинной фильтрации или TFF, биопроизводители изучают потенциальные применения использования акустической сепарации.
Это исследование предоставляет общий протокол для работы настольного акустического волнового сепаратора (AWS) для уточнения культуры клеток CHO, представляет репрезентативные данные и демонстрирует, как достичь эффективного осветления клеток и восстановления продукта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описан пошаговый протокол для реализации стендовой АВС в первичном уточнении модели моноклонального антитела из HCCF клеточной линии CHO. Как показано в репрезентативных результатах, использование AWS в первичном осветлении привело к эффективному осветлению клеток и восстановлению продукта. Кроме того, низкий уровень требований к техническому обслуживанию и эксплуатации, а также возможности масштабирования позволяют расширить возможности применения при первичном уточнении.
Важно отметить, что репрезентативные результаты свидетельствуют о том, что скорость подачи насоса имеет решающее значение для разделения ячеек. Кроме того, из-за ограничений в обнаружении высокой плотности ячеек при измерении мутности плотность рабочих ячеек является еще одним фактором, который следует учитывать при использовании системы AWS. Поскольку зонд мутности будет насыщен при работе с исходным материалом с высокой плотностью клеток, может быть лучше всего рассчитать эффективность разделения клеток, измерив плотность клеток исходного материала и осветленной жидкости клеточной культуры в автономном режиме. При точном автономном измерении прояснения одной из стратегий процесса, которую можно рассмотреть при решении этих проблем, является использование нескольких камер последовательно. Хотя этот протокол в первую очередь ориентирован на использование одной камеры, эта система может управлять тремя дополнительными камерами для последовательного осветления клеток, что может минимально влиять на состояние клеток и приводить к высокому извлечению продукта. Кроме того, другие параметры, такие как мощность для AWS и скорость потока удаления ячеек, могут быть дополнительно оптимизированы для конкретных типов ячеек или режима работы. В целом, оптимизация параметров работы и стратегии с использованием этих соображений рекомендуется перед внедрением AWS.
Среди многих потенциалов применения перспективным является использование AWS в непрерывной биообработке. Поскольку AWS может заменить центрифугирование и значительно уменьшить площадь поверхности фильтра14,использование AWS позволит обеспечить постоянный поток бесклеточного материала для последующих процессов фильтрации и хроматографии, совместимых с непрерывным биопроизводством. Благодаря такой совместимости и доступности технологии перфузии для высокой плотности клеток (например, >50 x 106 клеток/мл) и большей продолжительности культивирования (например, >14 дней), AWS имеет потенциал для разработки новой стратегии непрерывного клеточного кровотечения в дополнение к первичному осветлению.
В некоторых случаях до 30% белка, вырабатываемого терапевтически, удаляется во время стационарной работы в клеточном кровоточащем материале15,16. Кроме того, для того, чтобы удаленные моноклональные антитела были объединены со стандартным собранным материалом, должны быть соблюдены определенные атрибуты качества. Когда эти спецификации не выполняются, результатом может быть отказ от материала, который может повлиять на выход продукта. Чтобы компенсировать такие потери продукта, непрерывное осветление материала клеточного кровотечения с использованием AWS может быть реализовано в стационарном состоянии во время долгосрочного процесса перфузии17. Эта стратегия может уменьшить потери продукта в материале и использовать больше производимого белка. Кроме того, клетки после непрерывного осветления с использованием AWS потенциально могут быть добавлены обратно в биореактор, если это необходимо для более высокой плотности и производительности клеток. Таким образом, непрерывное осветление материала с обрезом ячеек с помощью AWS может дать возможность увеличить выход и/или уменьшить площадь поверхности вторичного фильтра в данном процессе.
Таким образом, полезность AWS не ограничивается простым первичным уточнением, но может иметь полезность для приложений непрерывной биообработки, что может повысить скорость производства и эксплуатационную гибкость.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Нилоу Сару Арден и Чжун Чжао за их конструктивное рецензирование этой рукописи. Авторы также хотели бы поблагодарить Линдси Браун за важный вклад в этот проект. Частичное внутреннее финансирование и поддержка этой работы были предоставлены Программой критического пути CDER (CA #1-13) и Программой CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence (Berilla-CoE-19-49). Этот проект был частично поддержан Программой стажировок / участия в исследованиях в Управлении биотехнологических продуктов Управления по контролю за продуктами и лекарствами США, управляемой Институтом науки и образования Оук-Ридж через межведомственное соглашение между Министерством энергетики США и FDA.
Эта публикация отражает взгляды автора и не должна толковаться как представляющая взгляды или политику FDA.
Materials
| Acoustophorectic chamber | Pall | CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit | |
| ActiCHO P | GE | SH31025.01 | powder medium |
| AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
| Cadence Acoustic Separator Software | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4 | |
| CHO-K1 cells | VRC | VRC01 | |
| Computer | Dell | Latitude 3470 | Windows 7, 64 bit OS |
| Isopropanol (70%) | LabChem | LC157605 | 20L prepped 70% IPA |
| L-glutamine | Corning | 25-005-CV | 200 mM stock solution |
| Masterflex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
| Masterflex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
| Tubing set | Pall | CAS-FP-K1 Tubing set | |
| Turbidity probe | Pall | CAS-TS-S1 (60500106) |
References
- Roush, D. J., Lu, Y. Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology. Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).
- Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification. Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).
- Shukla, A. A., Suda, E. . Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).
- Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology. Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).
- Singh, N., et al. Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).
- Ryll, T., et al. Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality. Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).
- Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).
- Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors. 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).
- Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting. The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).
- Dutra, B., et al. A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration. Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).
- Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. Acoustic perfusion devices. US patent. , (2017).
- Wu, X., et al. Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1. Science. 329 (5993), 856-861 (2010).
- Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures. Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).
- Wolf, M. K. F., et al. Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition. Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).
- Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media. Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).
- Emily, B., et al. Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling. BioProcess International. 8, 32-39 (2010).
