音響セパレータを用いたCHO採取細胞培養液の一次解明

1. AWSの準備 注:このプロトコルは、1つのアクーストレティックチャンバーを使用して開発されました。しかし、ベンチスケールのAWSには、必要に応じて4つのアクロスフォレティックチャンバーを直列に動作させることができる5つの濁度プローブがあります。 濁度ケーブルをF、1、2、3、4(例えば、図1cの濁度プローブ1、図2aのポート1)に、チャンバーパワーBNCケーブルを1、2、3、4とラベル付けされたAWSシステムの背面に接続します(図2b)。注:チャンバが流体で満たされている場合、ステップ2.6まで、チャンバ電源BNCケーブル(図3c)の他端を口和室の背面(図3d)に接続しないでください。チャンバーの電源がオンの場合、チャンバー内の流体がオンになっていると、チャンバー内のピエゾトランスデューサーが損傷し、機能しなくなります。 濁度プローブを濁度計と温度計ハウジングに挿入し、ネジを締めます(図1cおよび図3)。 フィードポンプを介してフィード濁度ポート(図4a)の入力にフィードチューブを接続します(図1b~1c)。 フィード濁度ポート(図4b)の出力からyチューブを、アクロスフォレティックチャンバーの入口ポートに接続します(図4c)。 ステージ1チューブを、房状室の廃口(図4d)からstage1ポンプを介して細胞回収容器に接続する(図1dは1e~1f)。 房口室の透過ポート(図4e)からプローブ1濁度ポートの入力にチューブを接続する(図4f)。 プローブ1濁度ポート(図4g)から収穫管を製品回収容器に接続します(図1c~1g)。 2. HCCF を使用してシステムをプライムする 注:このプロトコルは、化学定義培地(6 mM L-グルタミンを用いたActiCHO P)で培養されたCHO-K1細胞を用いて開発され、IgG1モノクローナル抗体VRC0113 を製造し、他の細胞株および製品に合わせて調整する必要がある。このプロトコルで使用されるHCCFは、揺れフラスコまたはバイオリアクタープロセスからCHO-K1培養の7〜8日間の終わりに得られました。 AWS の背面と前面の電源スイッチをオンにして、AWS をオンにします。 コンピュータの電源を入れ、関連するソフトウェアのデスク アイコンをダブルクリックします(「 資料一覧」を参照)。[読み取り値] パネルで [テストの開始] ボタンを押して、データの記録を開始します (図 5)。データの記録が開始されると、テストが停止されるまで、収集されたすべてのデータがエクスポート可能なスプレッドシートに記録されます。 フィードチューブエンドを、撹拌されるHCCF容器に接続します。 フィード ポンプのイメージ内の “コントロール” 画面にポンプ速度を入力し、キーボードのEnterキーを押して、フィード ポンプを起動します。「ポンプ方向矢印アイコン」(時計回りまたは反時計回り)が、送りポンプ画像の右側にある灰色のボックスで正しく選択され、HCCFが容器から房室にポンプで送り込まれるようにします。フィード ポンプ イメージの下にある灰色のボックスの横にある”三角形のアイコン” をクリックして、ポンプを開始します (図 6a)。注:最大ポンプ速度は10 L /h(167 mL/min)ですが、このステップでは、公称流量60 mL/minを使用して、分離を開始する前にチャンバを過剰充填することなくチューブとチャンバーを素早く充填することをお勧めします。 「パーセント削減パネル」(図5c)を、アフューストレティックチャンバーの充填中に観察して、飼料濁度測定を監視します。HCCFがHCCF容器に十分に混合されている場合、濁度値はチャンバのローディング中に一貫したままになります。 液体がアソフォティックチャンバーの背面にあるピエゾトランスデューサーの上に入ったら、フィードポンプ画像の下の灰色のボックス内で「Off」を押してポンプを停止します。BNC電源ケーブル(図3c)をアガストレティックチャンバー(図3d)に接続します。注:各アウストフォレティックチャンバーのホールドアップ量は約190 mLです。 3. AWSの運用 アクトフォレティック室が充填され、BNC電源ケーブルがアクトフォティックチャンバの背面に接続されたら、フィードポンプの速度を所望の動作速度に変更します(図6a および 表1)。特定のプロセスに最適な動作パラメータを特定するために、いくつかのフィードポンプレートをテストする必要があります。 電源モジュールのバーを 10 W (図 6d)にスライドし、ステージ 1 ボックスの右側にある[ON をオンにする] アイコンを押して stage1 の圧電電源をオンにします (図6c)。メーカーが提案したように、CHOセルの推奨電力設定である10 Wを使用してください。これにより、動作に対して 2 MHz の固定周波数が生成されます。数秒後、細胞はアユーストレティックチャンバーの波のノードに目に見えて集まり始めます(図7a)。 細胞がアフェストレティック室の底に落ち着き始めたら(図7b)、細胞密度とフィードポンプ速度に基づいて適切な速度でstage1ポンプを開始する(図6b)。メーカーの最適化と定常動作スプレッドシートに基づいて、stage1ポンプ速度は、次の式を使用して、パックされたセル質量とフィード流量に基づいて計算することができます パックされた細胞質量を計算するには、空の15 mLチューブ(または遠心分離と互換性のある他のチューブ)でスケールを引き換えます。チューブにフィード材料を充填し、チューブの総重量をフィードで記録します。3,700 x gで 10 分間チューブを遠心分離します。上清を別の容器にデカントします。細胞ペレットでチューブの重量を測定します。充填された細胞質量の供給材料の割合=(デカンテッドチューブ重量/充填チューブ重量)x 100%。 アフュートフォレティックチャンバーからのオーバーフローが濁度プローブ1に入り込むので、ステージ1の濁度プロファイルを監視する(図8)。 細胞分離が進むにつれて、細胞除去効率 が高まる。 また、細胞分離が続くにつれて、フィードとステージ1の温度差が大きくなるのを監視します(図9)。高いセル密度フィードを使用すると温度が上昇する可能性がありますが、一般的にはフィードの流量を変更することで低減できます。注:複数のアクトフォティックチャンバーを使用する場合、濁度プローブを介して以前のアクトフォティックチャンバーから現在のアクトフォレティックチャンバーの入力にチューブを順次接続できます。さらに、1つは、細胞収集容器にステージポンプを介して、アユーストフォティックチャンバーの底部からステージチューブを接続することができます。4つのアクトフォレティックチャンバーを直列に接続して、必要に応じて最適な細胞除去効率を実現します。 4. AWS の終了 実行が終わったら、フィードポンプとstage1ポンプ画像の下のグレーボックス内でそれぞれ [Off] を押して、フィードとstage1ポンプを停止し、ポンプを停止します。 ステージ 1 ボックスの右側にある [Off] を押して、チャンバーの電源を切り、BNC 電源ケーブルを外します。 深度ろ過法やクロマトグラフィー法など、さらに明確化および精製手順のために収集された製品収穫材料を取ります。細胞の収穫材料を捨てます。 廃棄物チューブを空の容器に入れ、口当たりの多いチャンバーの入口からチューブを切り離し、ポートに浸透させ、ポンプヘッドから廃棄物チューブを放出して、アカウストレティックチャンバー内の残りの流体を排出します。 チューブを再接続し、廃チューブをポンプヘッドに戻し、フィードポンプレート60 mL/minとstage1ポンプレート60 mL/minを使用して、フィードチューブの端からDI水を流します。15~20分続けます。フローを破棄します。 70%のイソプロピルアルコール(IPA)をチューブとチャンバーに送り込み、15〜20分間のフィードポンプを使用します。フローを破棄します。 15~20分間のフィードポンプを使用して、DI水で洗浄手順を繰り返し、チューブとチャンバーをクリアします。フローを破棄します。 濁度プローブとアガストフォレティックチャンバーからチューブを分解し、70%のIPAでエリアをきれいにします。 濁度プローブを分解し、70%のIPAで濁度プローブの内部をきれいにします。すべての部品を乾燥させてから、次の使用のために再組み立てしてください。注意:アフューストフォレティックチャンバーは、単一の使用のために製造されていますが、このプロトコルで説明されているように適切に処理および洗浄すれば再利用することができます。