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Bioengineering

Chiarificazione primaria del fluido di coltura cellulare raccolto da CHO utilizzando un separatore acustico

Published: May 14, 2020
doi:
10.3791/61161
, , ,
1Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II,U.S. Food and Drug Administration

Summary

Qui viene presentato un protocollo per la chiarificazione primaria della coltura cellulare CHO utilizzando un separatore acustico. Questo protocollo può essere utilizzato per la chiarificazione primaria di colture di pallone shake o raccolti di bioreattori e ha la potenziale applicazione per la chiarificazione continua del materiale di spurgo cellulare durante le operazioni del bioreattore di perfusione.

Abstract

La chiarificazione primaria è un passo essenziale in un processo di bioproduzione per la rimozione iniziale delle cellule dagli agenti terapeutici all’interno del fluido di coltura cellulare raccolto. Mentre i metodi tradizionali come la centrifugazione o la filtrazione sono ampiamente implementati per la rimozione delle celle, le apparecchiature per questi processi hanno grandi impronte e il funzionamento può comportare rischi di contaminazione e incrostazioni del filtro. Inoltre, i metodi tradizionali potrebbero non essere ideali per schemi di bioprocessing continuo per la chiarificazione primaria. Pertanto, è stata studiata un’applicazione alternativa che utilizza onde acustiche (sonore) per separare continuamente le cellule dal fluido di coltura cellulare. Presentato in questo studio è un protocollo dettagliato per l’utilizzo di un separatore di onde acustiche su scala di banco (AWS) per la separazione primaria del fluido di coltura contenente un anticorpo monoclonale IgG1 da un raccolto di bioreattore a cellule CHO. I dati rappresentativi vengono presentati da AWS e dimostrano come ottenere un efficace chiarimento delle cellule e il ripristino del prodotto. Infine, vengono discusse le potenziali applicazioni di AWS nel bioprocessing continuo. Nel complesso, questo studio fornisce un protocollo pratico e generale per l’implementazione di AWS nel chiarimento primario per le colture cellulari CHO e descrive ulteriormente il suo potenziale applicativo nel bioprocessing continuo.

Introduction

Un passo critico in un processo di bioproduzione che coinvolge proteine terapeutiche secrete è la rimozione della biomassa dal fluido di coltura cellulare raccolto (HCCF). Tradizionalmente, i bioproduttori hanno adottato la centrifugazione seguita dalla filtrazione di profondità come metodi di chiarificazione primari nella produzione di anticorpi monoclonali1. Tuttavia, la centrifugazione può portare ad un elevato sforzo di taglio sulle cellule, con conseguente aumento dei detriti cellulari nell’HCCF. Ciò può potenzialmente portare a incrostazioni del filtro durante la filtrazione e provocare contaminanti extra postfiltrazione che possono successivamente ridurre l’efficienza della cromatografia a valle1,2,3. Inoltre, la personalizzazione delle centrifughe per un determinato processo può essere costosa e può richiedere connessioni aggiuntive a sistemi clean-in-place e sterilizzati sul posto che possono anche essere un fattore limitante per la scalabilità. L’uso di filtri di profondità può compensare i limiti della centrifugazione e sfruttare anche la tecnologia monouso4. Tuttavia, i filtri di profondità vengono utilizzati principalmente come chiarificazione secondaria perché non possono sopportare alte densità di coltura cellulare5. In alternativa, i dispositivi di ritenzione cellulare di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) sono stati impiegati per mitigare lo stress da taglio, ma possono incontrare sfide come la polarizzazione della membrana e le scarse rese del raccolto6. I problemi di cui sopra derivanti dall’uso della centrifugazione più filtrazione di profondità o TFF creano un’opportunità per il miglioramento del processo di chiarificazione primaria di HCCF.

La separazione acustica è stata introdotta come tecnologia che può essere utilizzata per la raccolta di proteine secrete da colture cellulari con prodotti proteici di alta qualità7,8. La separazione acustica si ottiene attraverso la propagazione e la riflessione di onde stazionarie multidimensionali che interagiscono con fluidi sospesi e particelle trattenute9,10. Queste particelle sperimentano tre forze: resistenza del fluido, gravità e radiazione acustica. Quando ciascuna delle forze è ugualmente opposta l’una all’altra, raggiungendo l’equilibrio, le particelle sono sospese e intrappolate all’interno dell’onda stazionaria ultrasonica10. In una sospensione di coltura cellulare, le cellule sono tenute all’interno di questo piano del nodo di pressione delle onde stazionarie, il nodo cresce man mano che le cellule si fondono e alla fine questi gruppi di nodi cellulari cadono dalla forza gravitazionale9. Queste celle sedimentate vengono quindi rimosse dal mezzo, il che consente di pompare i mezzi chiarificati per un’ulteriore lavorazione a valle. L’utilizzo delle onde ultrasoniche come metodo di separazione ha iniziato a tradursi in applicazioni biologiche che vanno dalla separazione delle particelle lipidiche e dei globuli rossi11 alla coltura cellulare di perfusione dei mammiferi12. Con le sue capacità relative di ridurre i costi, la manodopera e lo stress cellulare evitando la centrifugazione, la filtrazione di profondità o il TFF, i bioproduttori stanno esplorando le potenziali applicazioni dell’utilizzo della separazione acustica.

Questo studio fornisce un protocollo generale per il funzionamento di un separatore di onde acustiche da banco (AWS) per il chiarimento della coltura cellulare CHO, presenta dati rappresentativi e dimostra come ottenere un efficace chiarimento cellulare e recupero del prodotto.

Protocol

1. Preparazione di AWS NOTA: Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando una camera acustoforetica. Tuttavia, AWS su scala da banco dispone di cinque sonde di torbidità in grado di gestire 4 camere acustoforetiche in serie, se necessario. Collegare i cavi di torbidità alle rispettive porte etichettate come F, 1, 2, 3, 4 (ad esempio, sonda di torbidità 1 nella Figura 1c e porta 1 nella Figura 2a) e i cavi BNC di alimentazione della camera sul retro del sistema AWS etichettati come 1, 2, 3, 4 (Figura 2b).NOTA: non collegare l’altra estremità del cavo BNC di alimentazione della camera (Figura 3c) al retro della camera acustoforetica (Figura 3d) fino al passaggio 2.6 quando la camera è riempita di liquido. Se l’alimentazione della camera è accesa senza fluido nella camera, danneggerà il trasduttore piezoelettrico nella camera e non funzionerà più. Inserire le sonde di torbidità nell’alloggiamento del misuratore di torbidità e del termometro e stringere le viti (Figura 1c e Figura 3). Collegare il tubo di alimentazione all’ingresso della porta di torbidità di alimentazione (Figura 4a) tramite la pompa di alimentazione (Figura da 1b a 1c). Collegare il tubo a y dall’uscita della porta di torbidità di alimentazione (Figura 4b) alle porte di ingresso della camera acustoforetica (Figura 4c). Collegare il tubo stage1 dal porto di scarico della camera acustoforetica (Figura 4d) tramite la pompa stage1 a un recipiente di raccolta cellulare (Figura 1d via 1e a 1f). Collegare il tubo dalla porta permeata della camera acustoforetica (Figura 4e) all’ingresso della porta di torbidità probe1 (Figura 4f). Collegare il tubo di raccolta dall’esterno della porta di torbidità probe1 (Figura 4g) a un recipiente di raccolta del prodotto (Figura da 1c a 1g). 2. Innescare il sistema con HCCF NOTA: Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando cellule CHO-K1 coltivate in mezzo chimicamente definito (ActiCHO P con 6 mM di L-glutammina) che producono l’anticorpo monoclonale modello IgG1 VRC0113 e potrebbe essere necessario aggiustare per altre linee cellulari e prodotti. L’HCCF utilizzato in questo protocollo è stato ottenuto alla fine di 7-8 giorni di colture CHO-K1 da un pallone vibrante o da un processo di bioreattore. Attiva AWS attivando gli interruttori di alimentazione sul retro e sulla parte anteriore dell’AWS. Accendere il computer e fare doppio clic sull’icona della scrivania per il software associato (vedere Tabella dei materiali). Dal pannello “Letture”, premere il pulsante “Avvia test” per avviare la registrazione dei dati (Figura 5). Una volta avviata la registrazione dei dati, tutti i dati raccolti verranno registrati in un foglio di calcolo esportabile fino all’interruzione del test. Collegare l’estremità del tubo di alimentazione al recipiente HCCF che viene agitato. Avviare la pompa di alimentazione inserendo la velocità della pompa nella schermata “Controlli” all’interno dell’ “Immagine pompa di alimentazione” e premere “Invio” sulla tastiera. Assicurarsi che l’ icona dellafreccia di direzione della pompa(in senso orario o antiorario) sia selezionata correttamente nella casella grigia a destra dell’immagine della pompa di alimentazione per pompare HCCF dal recipiente nella camera acustoforetica. Fare clic sull’icona deltriangoloaccanto alle parole”Accendi”all’interno della casella grigia sotto l’immagine della pompa di alimentazione per “Avviare” la pompa (Figura 6a).NOTA: la portata massima della pompa è di 10 L/h (167 mL/min), ma si consiglia di utilizzare la portata nominale, 60 mL/min, per questa fase per riempire rapidamente il tubo e la camera senza rischiare di riempire eccessivamente la camera prima di iniziare la separazione. Monitorare le misure di torbidità di alimentazione osservando il “Pannello di riduzione percentuale” (Figura 5c) durante il riempimento della camera acustoforetica. I valori di torbidità rimarranno coerenti durante il carico della camera se l’HCCF viene miscelato sufficientemente nel recipiente HCCF. Una volta che il liquido si trova sopra il trasduttore piezoelettrico sul retro della camera acustoforetica, premere “Spegni” all’interno della scatola grigia sotto l’immagine della pompa di alimentazione per arrestare la pompa. Collegare il cavo di alimentazione BNC (Figura 3c) alla camera acustoforetica (Figura 3d).NOTA: Il volume di attesa di ciascuna camera acustoforetica è di circa 190 ml. 3. Funzionamento di AWS Una volta riempita la camera acustoforetica e collegato il cavo di alimentazione BNC al retro della camera acustoforetica, modificare la velocità della pompa di alimentazione alla velocità operativa desiderata (Figura 6a e Tabella 1). Diverse velocità della pompa di alimentazione devono essere testate per identificare i parametri operativi ideali per un determinato processo. Accendere l’alimentazione piezoelettrica stage1 facendo scorrere la barra nel modulo di alimentazione a 10 W (Figura 6d) e premendo l’icona “Accendi” sul lato destro della casella Stage 1 (Figura 6c). Come suggerito dal produttore, utilizzare 10 W, l’impostazione di alimentazione consigliata per le celle CHO. Questo genererà una frequenza fissa di 2 MHz per il funzionamento. Dopo alcuni secondi, le cellule inizieranno a raggrupparsi visibilmente ai nodi d’onda nella camera acustoforetica (Figura 7a). Una volta che le cellule iniziano a depositarsi sul fondo della camera acustoforetica (Figura 7b), avviare la pompa stage1 con una velocità appropriata in base alla densità della cella e alla velocità della pompa di alimentazione (Figura 6b). Sulla base dell’ottimizzazione del produttore e del foglio di calcolo del funzionamento stazionario, la velocità della pompa stage1 può essere calcolata in base alla massa della cella imballata e alla portata di alimentazione utilizzando la seguente equazione Per calcolare la massa della cella imballata, tarare una scala con un tubo vuoto da 15 ml (o un altro tubo compatibile con la centrifugazione). Riempire il tubo con materiale di alimentazione e registrare il peso totale del tubo con l’alimentazione. Centrifugare il tubo per 10 minuti a 3.700 x g. Decantare il surnatante in un contenitore separato. Misurare il peso del tubo con il pellet di cella. La percentuale di massa della cella imballata del materiale di alimentazione = (peso del tubo decantato/peso del tubo riempito) x 100%. Monitorare il profilo di torbidità della torbidità dello stadio 1 quando il trabocco dalla camera acustoforetica entra nella sonda di torbidità1 (Figura 8). Man mano che la separazione cellulare continua, l’efficienza di rimozione delle cellule aumenterà. Inoltre, monitorare la differenza di temperatura tra alimentazione e fase1 in quanto aumenterà man mano che la separazione cellulare continua (Figura 9). La temperatura può aumentare quando viene utilizzato un alimentatore a densità di cella più elevata, ma può generalmente essere ridotto alterando la portata di alimentazione.NOTA: Quando si utilizzano più camere acustoforetiche, è possibile collegare sequenzialmente il tubo dalla camera acustoforetica precedente tramite sonde di torbidità all’ingresso della camera acustoforetica corrente. Inoltre, è possibile collegare i tubi dello stadio dal fondo delle camere acustoforetiche tramite pompe di stadio ai vasi di raccolta delle celle. Un totale di quattro camere acustoforetiche possono essere collegate in serie per un’efficienza ottimale di rimozione delle celle, se necessario. 4. Fine di AWS Al termine della corsa, arrestare l’alimentazione e la pompa stage1 premendo spegni all’interno della scatola grigia sotto la pompa di alimentazione e le immagini della pompa stage1, rispettivamente, per arrestare le pompe. Spegnere l’alimentazione della camera premendo Spegni sul lato destro della scatola Stage 1 e scollegare il cavo di alimentazione BNC. Prendi il materiale di raccolta del prodotto raccolto per ulteriori procedure di chiarificazione e purificazione, come i metodi di filtrazione in profondità e cromatografia. Scartare il materiale di raccolta delle cellule. Scaricare il fluido rimanente nella camera acustoforetica posizionando il tubo di scarico in un recipiente vuoto, scollegando il tubo dall’ingresso della camera acustoforetica e dalle porte di permeazione e rilasciando il tubo di scarico dalla testa della pompa. Ricollegare il tubo, riposizionare il tubo di scarico nella testa della pompa e fluire attraverso l’acqua DI dall’estremità del tubo di alimentazione utilizzando una velocità della pompa di alimentazione di 60 ml / min e una velocità della pompa stage1 di 60 ml / min. Proseguire per 15-20 min. Scartare il flusso attraverso. Pompare il 70% di alcool isopropilico (IPA) attraverso il tubo e la camera utilizzando la pompa di alimentazione per 15-20 minuti. Scartare il flusso attraverso. Ripetere la procedura di pulizia con acqua DI per liberare i tubi e la camera utilizzando la pompa di alimentazione per 15-20 minuti. Scartare il flusso attraverso. Smontare il tubo dalle sonde di torbidità e dalle camere acustoforetiche e pulire l’area con il 70% di IPA. Smontare le sonde di torbidità e pulire all’interno delle sonde di torbidità con 70% IPA. Lasciare asciugare all’aria tutte le parti e quindi rimontare per l’uso successivo.NOTA: Le camere acustoforetiche sono prodotte per uso singolo ma possono essere riutilizzate se maneggiate e pulite correttamente come descritto in questo protocollo.

Representative Results

Come descritto nel protocollo, AWS è stato utilizzato per chiarire HCCF a una densità di 12,4 x 106 celle/ml, come mostrato nella Figura 1. La pompa di alimentazione è stata impostata a 3,5 ml / min (5 L / die), che rappresenta una velocità di spurgo delle cellule all’interno del presunto intervallo adatto per una coltura di 10-20 L. Quando l’HCCF è entrato nella camera AWS, le misurazioni di torbidità dalla sonda di torbidità di alimentazione sono rimaste coerenti, circa 1.000-1.100 NTU, e le misurazioni dalla sonda di torbidità probe1 sono rimaste intorno a 40-50 NTU (Figura 8). Utilizzando le due misurazioni, l’efficienza di rimozione delle celle è stato calcolato e in media del 95%. Si è riscontrato che una misurazione della torbidità di 40-50 NTU era il livello minimo di torbidità raggiungibile e quindi non era possibile alcuna ulteriore separazione da una camera AWS aggiuntiva in serie. Mentre l’AWS poteva separarsi con alta efficienza a portate più basse, mantenere l’HCCF per un tempo più lungo all’interno della camera causava aumenti di temperatura, che dovrebbero essere una considerazione quando si selezionano portate più basse. La figura 9 è un esempio della differenza di temperatura dell’HCCF prima di entrare nella camera acustoforetica e dopo la separazione acustica a una portata di alimentazione di 3,5 ml / min, che ha mostrato un aumento della temperatura di >6 °C a causa del tempo prolungato all’interno della camera acustica. Un’altra considerazione importante quando si eseguono raccolti ad alta densità cellulare (ad esempio, >20 x10 6 celle / mL) è la saturazione delle sonde di torbidità. Le misurazioni della torbidità per la sonda di torbidità di alimentazione sono diventate sature di oltre 4.400 NTU (Figura 10), il che può comportare una sottostima nel calcolo dell’efficienza di rimozione delle celle. Per testare l’effetto delle diverse velocità di alimentazione sulla chiarificazione cellulare, l’efficienza di rimozione delle cellule è stata misurata a diverse velocità di avanzamento. Come mostrato nella Figura 11,l’efficienza di rimozione delle celle è diminuita significativamente da ~ 100% a 57% all’aumentare della velocità della pompa di alimentazione. In generale, più lenta è la velocità della pompa di alimentazione, migliore è la chiarificazione della cella. Tuttavia, l’ottimizzazione della velocità di avanzamento è raccomandata per ogni applicazione. Figura 1: Configurazione aws. Una volta accese le pompe con il software (a), l’HCCF è stato incanalato tramite una pompa di alimentazione (b) attraverso la sonda di torbidità di alimentazione (c) quindi alla camera AWS (d). All’interno della camera, le forze acustiche hanno intrappolato le cellule dal flusso nei nodi delle onde e hanno causato l’aggregazione. La diminuzione della galleggiabilità ha causato la caduta delle cellule attraverso la forza gravitazionale e le cellule sono state rimosse dal porto di scarico della camera acustoforetica tramite la pompa stage1 (e) a una bottiglia di raccolta cellulare (f) mentre il materiale chiarificato è uscito alla sonda di torbidità probe1 (c) attraverso la porta permeata della camera a una bottiglia di raccolta del prodotto (g). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Retro del sistema AWS. Le sonde di torbidità e le camere sono collegate alle rispettive porte sul retro del sistema AWS tramite cavi Ethernet della sonda di torbidità(a)e BNC(b)della sonda di torbidità. Inoltre, il computer è collegato tramite cavo Ethernet PC (c). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Sonde di torbidità e alloggiamento. Ogni sonda di torbidità (a) deve essere correttamente inserita al rispettivo torbidometro e all’alloggiamento del termometro (b) e serrata con le viti. Il cavo BNC di alimentazione della camera (c) deve essere collegato alla parte posteriore della camera acustoforetica (d) solo dopo che il trasduttore piezoelettrico nella camera è stato riempito di liquido. Le sonde sono indicate come segue: F = torbidità di alimentazione, 1 = torbidità della sonda1 e 2, 3 e 4 sono sonde inutilizzate (o possono essere utilizzate per serializzare la procedura). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Connessione tra l’alloggiamento della torbidità e la camera acustoforetica. Il tubo di alimentazione è collegato all’ingresso della porta di torbidità di alimentazione (a) tramite la pompa di alimentazione. L’uscita della porta di torbidità di alimentazione (b) è collegata alle porte di ingresso della camera acustoforetica (c) tramite tubo y. Il tubo stage1 è collegato dal porto di scarico della camera acustoforetica (d) tramite la pompa stage1 a un recipiente di raccolta cellulare. La porta permeata della camera acustoforetica (e) è collegata all’ingresso della porta di torbidità probe1 (f). Il tubo di raccolta è collegato dalla porta di torbidità probe1 (g) a un recipiente di raccolta del prodotto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Pannello Letture nel software Separatore acustico. Il programma ha due pannelli, “Letture” e “Controlli”. All’interno del pannello “Letture” vengono monitorate la torbidità(a),la temperatura(b)e la riduzione percentuale(c). Per avviare la registrazione dei dati, è necessario fare clic sul pulsante “Avvia test”(d),che cambierà il colore del pulsante in verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Pannello Controlli nel programma. All’interno del pannello”Controlli”,le pompe possono essere accese o spente e la velocità di pompaggio può essere modificata per l’alimentazione(a)e altre fasi(b). Inoltre, l’alimentazione della camera sul trasduttore piezoelettrico può essere accesa ospenta( c ) ed essere modificata con una barra di scorrimento (d). Gli esperimenti hanno utilizzato 10 W, perché è l’impostazione di potenza consigliata per le celle CHO come raccomandato dal produttore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Camera AWS. Una volta che le cellule erano all’interno della camera, le forze acustiche intrappolavano le cellule nei nodi delle onde e causavano il raggruppamento delle cellule (a). Questi ammassi di cellule sono aumentati di dimensioni fino a quando non hanno perso la loro galleggiabilità e alla fine si sono stabilizzati dalla forza gravitazionale (b). Successivamente, le cellule depositate sono state rimosse dal porto di scarico della camera acustoforetica tramite la pompa stage1 a una bottiglia di raccolta cellulare (c). Il prodotto è uscito dalla camera attraverso la porta permeata (d) mentre HCCF ha riempito continuamente la camera tramite porte di ingresso (e). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Misure di torbidità per una coltura cellulare CHO 12 x10 6 celle/mL con una velocità della pompa di alimentazione di 3,5 ml/min. La torbidità di alimentazione (blu) era di circa 1.000 NTU e il permeato che usciva dal misuratore di torbidità dello stadio 1 (arancione) era di 40-60 NTU. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9: Misurazioni della temperatura per una coltura cellulare CHO 12 x10 6 celle/mL con una velocità della pompa di alimentazione di 3,5 ml/min. La temperatura di alimentazione (blu) era di circa 21 °C e il permeato che usciva dal misuratore di torbidità dello stadio 1 (arancione) era di circa 27 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 10: Esempio di misurazione della torbidità per un campione ad alta densità di cella. Quando la densità della cella era >20 x 106 celle/mL, la misura della torbidità di alimentazione era satura al valore massimo di 4.400 NTU, con conseguente sottostima dell’efficienza di rimozione delle celle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 11: Confronto dell’efficienza di rimozione delle celle. Con l’aumentare della velocità di avanzamento, la separazione cellulare è diminuita. Quindi, con l’aumentare della velocità di avanzamento, l’efficienza di chiarificazione delle celle è diminuita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Parametro Specificazione Portata 0 – 10 L/h Intervallo di pressione 0 – 2 bar (0 – 30 psi) Temperatura del fluido di alimentazione 0 – 40 °C (32 – 104 °F) Temperatura 0 – 40 °C (32 – 104 °F) Tabella 1: Condizioni operative. Le condizioni operative consigliate dal produttore AWS per portata, intervallo di pressione, fluido di alimentazione e temperatura di esercizio.

Discussion

Descritto è un protocollo passo-passo per l’implementazione di un AWS su scala di banco nel chiarimento primario di un modello di anticorpo monoclonale da HCCF di una linea cellulare CHO. Come mostrato nei risultati rappresentativi, l’uso di AWS nel chiarimento primario ha portato a un efficace chiarimento delle cellule e al recupero del prodotto. Inoltre, il basso livello di manutenzione e i requisiti operativi e la capacità di scale-up consentono un più ampio potenziale applicativo nella chiarificazione primaria.

È importante sottolineare che i risultati rappresentativi suggeriscono che la velocità della pompa di alimentazione è fondamentale per la separazione delle celle. Inoltre, a causa delle limitazioni nel rilevamento dell’elevata densità delle celle nella misurazione della torbidità, la densità delle celle di lavoro è un altro fattore da considerare quando si utilizza un sistema AWS. Poiché la sonda di torbidità sarà satura durante l’esecuzione di materiale di alimentazione ad alta densità cellulare, potrebbe essere meglio calcolare l’efficienza di separazione cellulare misurando le densità cellulari del materiale di alimentazione e chiarendo il fluido di coltura cellulare offline. Con un’accurata misurazione offline del chiarimento, una strategia di processo che può essere presa in considerazione nella risoluzione di questi problemi è quella di utilizzare più camere in serie. Sebbene questo protocollo si concentri principalmente sull’utilizzo di una singola camera, questo sistema può azionare tre camere aggiuntive per la chiarificazione sequenziale delle cellule che possono influire minimamente sulle condizioni delle cellule e comportare un elevato recupero del prodotto. Inoltre, altri parametri, come l’alimentazione per AWS e le portate di rimozione delle celle, possono essere ulteriormente ottimizzati per specifici tipi di celle o modalità operative. Nel complesso, prima dell’implementazione di AWS si consiglia un’ottimizzazione dei parametri operativi e della strategia utilizzando queste considerazioni.

Tra i molti potenziali applicativi, l’uso di AWS nel bioprocessing continuo è promettente. Poiché AWS può sostituire la centrifugazione e ridurre drasticamente la superficie del filtro14,l’uso di AWS consentirebbe un flusso costante di materiale privo di cellule per i successivi processi di filtrazione e cromatografia compatibili con la bioproduzione continua. Grazie a questa compatibilità e alla disponibilità della tecnologia di perfusione per un’elevata densità cellulare (ad esempio, >50 x10 6 celle/ml) e una maggiore durata della coltura (ad esempio, >14 giorni), AWS ha il potenziale per sviluppare una nuova strategia di sanguinamento cellulare continuo oltre al chiarimento primario.

In alcuni casi, fino al 30% della proteina terapeutica prodotta viene rimossa durante il funzionamento allo stato stazionario nel materiale di spurgo cellulare15,16. Inoltre, affinché gli anticorpi monoclonali rimossi siano raggruppati con il materiale raccolto standard, devono essere soddisfatti alcuni attributi di qualità. Quando queste specifiche non sono soddisfatte, il risultato può essere un rifiuto del materiale che può influire sulla resa del prodotto. Per compensare tale perdita di prodotto, è possibile implementare un chiarimento continuo del materiale di spurgo cellulare utilizzando AWS in condizioni stazionarie durante un processo di perfusione a lungo termine17. Questa strategia può ridurre la perdita di prodotto nel materiale di spurgo e utilizzare più proteine prodotte. Inoltre, le cellule dopo il continuo chiarimento utilizzando AWS potrebbero potenzialmente essere aggiunte di nuovo nel bioreattore, se lo si desidera, per una maggiore densità e produttività delle cellule. Pertanto, la chiarificazione continua del materiale di spurgo cellulare con AWS può offrire l’opportunità di aumentare la resa e/o diminuire la superficie del filtro secondario in un determinato processo.

In sintesi, l’utilità di AWS non si limita al semplice chiarimento primario, ma può avere utilità per applicazioni nel bioprocessing continuo che possono migliorare il tasso di produzione e la flessibilità operativa.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero ringraziare Nilou Sarah Arden e Zhong Zhao per la loro revisione costruttiva di questo manoscritto. Gli autori vorrebbero anche ringraziare Lindsey Brown per il contributo essenziale durante questo progetto. Il finanziamento interno parziale e il supporto per questo lavoro sono stati forniti dal CDER Critical Path Program (CA #1-13) e dal CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49). Questo progetto è stato sostenuto in parte dal programma di partecipazione allo stage / ricerca presso l’Office of Biotechnology Products, Food and Drug Administration degli Stati Uniti, amministrato dall’Oak Ridge Institute for Science and Education attraverso un accordo interagenzia tra il Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti e la FDA.

Questa pubblicazione riflette le opinioni dell’autore e non deve essere interpretata per rappresentare le opinioni o le politiche della FDA.

Materials

Acoustophorectic chamber Pall CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit
ActiCHO P GE SH31025.01 powder medium
AWS Pall CAS-SYS (60500101-SP)
Cadence Acoustic Separator Software Pall Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4
CHO-K1 cells VRC VRC01
Computer Dell Latitude 3470 Windows 7, 64 bit OS
Isopropanol (70%) LabChem LC157605 20L prepped 70% IPA
L-glutamine Corning 25-005-CV 200 mM stock solution
Masterflex L/S 14 tubing Cole-Parmer 96400-14 peroxide-cured silicone tubing, 25ft
Masterflex L/S 16 tubing Cole-Parmer 96400-16 peroxide-cured silicone tubing, 25ft
Tubing set Pall CAS-FP-K1 Tubing set
Turbidity probe Pall CAS-TS-S1 (60500106)
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CHOHarvested Cell Culture FluidAcoustic Wave SeparatorPrimary ClarificationTurbidityCell-freeContinuous BioprocessingFiltrationChromatography

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Hong, J. S., Azer, N., Agarabi, C., Fratz-Berilla, E. J. Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator. J. Vis. Exp. (159), e61161, doi:10.3791/61161 (2020).
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