הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי
Summary
מוצג כאן פרוטוקול להבהרה הראשונית של תרבית התא CHO באמצעות מפריד אקוסטי. פרוטוקול זה יכול לשמש להבהרה העיקרית של תרביות בקבוקון שייק או קציר ביו-ריאקטור ויש לו את היישום הפוטנציאלי להבהרה מתמשכת של חומר הדימום התאי במהלך פעולות bioreactor זלוף.
Abstract
הבהרה ראשונית היא צעד חיוני בתהליך biomanufacturing להסרה הראשונית של תאים ממוצרים טיפוליים בתוך נוזל תרבית התא שנקטף. בעוד שיטות מסורתיות כמו צנטריפוגה או סינון מיושמות באופן נרחב להסרת תאים, הציוד עבור תהליכים אלה יש עקבות גדולות ותפעול יכול לכלול סיכוני זיהום ועבירות מסנן. בנוסף, שיטות מסורתיות לא יכול להיות אידיאלי עבור תוכניות עיבוד ביולוגי מתמשך להבהרה ראשונית. לכן, יישום חלופי באמצעות גלים אקוסטיים (קול) נחקר להפריד תאים ללא הרף מנוזל תרבית התא. במחקר זה מוצג פרוטוקול מפורט לשימוש במפריד גלים אקוסטי בקנה מידה ספסל (AWS) להפרדה העיקרית של נוזל תרבות המכיל נוגדן IgG1 חד שבטי מקציר ביו-קטור של תאי CHO. נתונים מייצגים מוצגים מ- AWS ומדגימים כיצד להשיג הבהרה יעילה של תאים ושחזור מוצרים. לבסוף, יישומים פוטנציאליים עבור AWS 20000000000000000000000000000000000000000000000000 בסך הכל, מחקר זה מספק פרוטוקול מעשי וכללי ליישום AWS בהבהרה ראשונית עבור תרביות תאים CHO ומתאר עוד יותר את פוטנציאל היישום שלה תהליך ביולוגי מתמשך.
Introduction
צעד קריטי בתהליך ביו-מנופרקט הכולל חלבונים טיפוליים מופרשים הוא הסרת ביומסה מנוזל תרבית תאים שנקטפו (HCCF). באופן מסורתי, biomanufacturers אימצו צנטריפוגה ואחריו סינון עומק כשיטות ההבהרה העיקריות שלהם בייצור נוגדנים חד שבטיים1. עם זאת, צנטריפוגה עלולה להוביל ללחץ גיסת גבוה על התאים, וכתוצאה מכך פסולת תאית מוגברת ב- HCCF. זה יכול להוביל סינון עכירה במהלך סינון וכתוצאה מכך מזהמים נוספים לאחר סינון שיכול לאחר מכן להפחית את יעילות הכרומטוגרפיה במורד הזרם1,2,3. יתר על כן, ההתאמה האישית של הצנטריפוגות עבור תהליך מסוים יכולה להיות יקרה ועשויה לדרוש חיבורים נוספים למערכות נקיות במקום ועיקור במקום שעשויות להיות גם גורם מגביל למדרגיות. השימוש במסנני עומק יכול לפצות על מגבלות צנטריפוגה וגם לנצל את הטכנולוגיה החד פעמית4. עם זאת, מסנני עומק משמשים בעיקר כהבהרה משנית מכיוון שהם אינם יכולים לעמוד בצפיפות תרבית תאים גבוהה5. לחלופין, סינון זרימה משיק (TFF) התקני שימור תאים שימשו כדי להקל על מתח הגיאה, אך עשוי להיתקל באתגרים כגון קיטוב ממברנה ותפוקות קציר גרועות6. הסוגיות הנ”ל הנובעות משימוש ב-centrifugation בתוספת סינון עומק או TFF יוצרות הזדמנות לשיפור תהליך ההבהרה העיקרי של HCCF.
הפרדה אקוסטית הוצגה כטכנולוגיה שניתן להשתמש בה לקציר חלבונים מופרשים מתרביות תאים עם מוצרי חלבון באיכות גבוהה7,8. הפרדה אקוסטית מושגת באמצעות התפשטות והשתקפות של גלים עומדים רב ממדיים אינטראקציה עם נוזלים מושעים וחלקיקים שמורים9,10. חלקיקים אלה חווים שלושה כוחות: גרירת נוזלים, כוח המשיכה וקרינה אקוסטית. כאשר כל אחד מהכוחות מתנגדים זה לזה באותה מידה, להגיע שיווי משקל, החלקיקים מושעים ונלכדים בתוך גל עומד קולי10. בהשעיית תרבית תאים, תאים מוחזקים בתוך מישור צומת הלחץ הזה של גלים עומדים, הצומת גדל ככל שהתאים מתמזגים, ובסופו של דבר אשכולות אלה של צמתים תאיים נופלים מכוח הכבידה9. תאים מחושעים אלה מוסרים מהתקשורת, מה שמאפשר לשאיבה של אמצעי התקשורת המובהרים לעיבוד במורד הזרם. ניצול של גלים קוליים כשיטת הפרדה החל לתרגם ליישומים ביולוגיים החל הפרדה של חלקיקי שומנים ותאי דם אדומים11 לתרבות תאי זלוף יונקים12. עם היכולות היחסיות שלה כדי להפחית עלויות, עבודה, ומתח תאי על ידי הימנעות צנטריפוגה, סינון עומק, או TFF, biomanufacturers בוחנים את היישומים הפוטנציאליים של שימוש בהפרדה אקוסטית.
מחקר זה מספק פרוטוקול כללי להפעלת מפריד גלים אקוסטי ספסל (AWS) להבהרה של תרבות התא CHO, מציג נתונים מייצגים, ומדגים כיצד להשיג הבהרה תא יעיל ושחזור המוצר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתואר הוא פרוטוקול שלב אחר שלב ליישום AWS בקנה מידה ספסל בהבהרה ראשונית של נוגדן חד שבטי מודל מ HCCF של קו תא CHO. כפי שניתן לראות בתוצאות הייצוגיות, השימוש ב- AWS בהבהרה ראשונית הביא להבהרה יעילה של התאים ולשחזור המוצר. יתר על כן, הרמה הנמוכה של דרישות תחזוקה ותפעול ויכולת הרחבה מאפשרים פוטנציאל יישום רחב יותר בהבהרה ראשונית.
חשוב לציין, התוצאות הייצוגיות מצביעות על כך שקצב משאבת ההזנה הוא קריטי להפרדת התאים. בנוסף, בשל מגבלות בזיהוי צפיפות תאים גבוהה במדידת עכוז, צפיפות תאי עבודה היא גורם נוסף שיש לקחת בחשבון בעת שימוש במערכת AWS. מכיוון שמבחן הערוץ יהיה רווי בעת הפעלת חומר הזנה בצפיפות תאים גבוהה, ייתכן שעדיף לחשב את יעילות הפרדת התאים על ידי מדידת צפיפות התאים של חומר ההזנה ונוזל תרבית התאים המובהר במצב לא מקוון. עם מדידה לא מקוונת מדויקת של הבהרה, אסטרטגיית תהליך אחת שניתן לשקול בפתרון בעיות אלה היא להשתמש בתאים מרובים בסדרות. למרות פרוטוקול זה מתמקד בעיקר באמצעות תא אחד, מערכת זו יכולה להפעיל שלושה תאים נוספים להבהרה רציפה של התאים שיכולים להשפיע באופן מינימלי על מצב התאים ולהביא להתאוששות מוצר גבוהה. בנוסף, פרמטרים אחרים, כגון צריכת חשמל עבור AWS וקצבי זרימת הסרת תאים, ניתן למטב עוד יותר עבור סוגי תאים ספציפיים או מצב פעולה. בסך הכל, מומלץ אופטימיזציה של הפרמטרים והאסטרטגיה של הפעולה באמצעות שיקולים אלה לפני יישום AWS.
בין פוטנציאל יישום רבים, השימוש AWS תהליך ביולוגי מתמשך הוא מבטיח. מכיוון ש- AWS יכול להחליף צנטריפוגה ולהפחית באופן דרסטי את שטח פני השטח של המסנן14, השימוש ב- AWS יאפשר זרימה מתמדת של חומר ללא תאים לתהליכי סינון וכרומטוגרפיה הבאים התואמים לתהליכי ביו-אופן מתמשכים. בשל תאימות זו וזמינות טכנולוגיית זלוף לצפיפות תאים גבוהה (למשל, >50 x 106 תאים/מ”ל) ומשך תרבות ארוך יותר (לדוגמה, >14 ימים), ל- AWS יש פוטנציאל לפתח אסטרטגיית דימום תאים רציפה חדשנית בנוסף להבהרה הראשונית.
במקרים מסוימים, עד 30% של חלבון טיפולי המיוצר מוסר במהלך פעולה במצב יציב בחומר לדמם התא15,16. בנוסף, כדי שהנוגדנים החד שבטיים שהוסרו יתאחדו עם החומר שנקטף הסטנדרטי יש לעמוד בתכונות איכות מסוימות. כאשר מפרטים אלה אינם מתקיימים, התוצאה עשויה להיות דחייה של חומר שיכול להשפיע על תפוקת המוצר. כדי לפצות על אובדן מוצר כזה, הבהרה מתמשכת של חומר דימום התא באמצעות AWS יכול להיות מיושם במצב יציב במהלך תהליך זלוף לטווח ארוך17. אסטרטגיה זו עשויה להפחית את אובדן המוצר בחומר הדימום ולנצל יותר מהחלבון המיוצר. בנוסף, תאים לאחר ההבהרה המתמשכת באמצעות AWS עלולים להתווסף בחזרה לתוך bioreactor אם תרצה צפיפות תאים גבוהה יותר ופרודוקטיביות. לפיכך, בירור מתמשך של חומר בלימת תאים עם AWS עשוי להציע הזדמנות להגדיל את התשואה ו /או להקטין שטח פנים סינון משני בתהליך נתון.
לסיכום, השירות של AWS אינו מוגבל להבהרה ראשונית פשוטה, אך עשוי להיות כלי עזר עבור יישומים תהליך ביולוגי מתמשך שעשוי לשפר את קצב הייצור ואת הגמישות התפעולית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לנילו שרה ארדן וז’ונג זאו על הביקורת הבונה שלהם על כתב היד הזה. המחברים גם רוצים להודות ללינדסי בראון על קלט חיוני במהלך הפרויקט הזה. מימון פנימי חלקי ותמיכה בעבודה זו סופקו על ידי תוכנית הנתיב הקריטי CDER (CA #1-13) ותוכנית מדע הייצור של CDER, מרכז החדשנות למצוינות (ברילה-CoE-19-49). פרויקט זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית ההתמחות /מחקר השתתפות במשרד למוצרי ביוטכנולוגיה, מינהל המזון והתרופות האמריקאי, המנוהל על ידי מכון Oak Ridge למדע וחינוך באמצעות הסכם בין סוכנויות בין משרד האנרגיה האמריקאי ל- FDA.
פרסום זה משקף את דעותיו של המחבר ואין לפרש אותו כדי לייצג את השקפות ה-FDA או את המדיניות שלו.
Materials
| Acoustophorectic chamber | Pall | CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit | |
| ActiCHO P | GE | SH31025.01 | powder medium |
| AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
| Cadence Acoustic Separator Software | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4 | |
| CHO-K1 cells | VRC | VRC01 | |
| Computer | Dell | Latitude 3470 | Windows 7, 64 bit OS |
| Isopropanol (70%) | LabChem | LC157605 | 20L prepped 70% IPA |
| L-glutamine | Corning | 25-005-CV | 200 mM stock solution |
| Masterflex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
| Masterflex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
| Tubing set | Pall | CAS-FP-K1 Tubing set | |
| Turbidity probe | Pall | CAS-TS-S1 (60500106) |
References
- Roush, D. J., Lu, Y. Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology. Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).
- Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification. Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).
- Shukla, A. A., Suda, E. . Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).
- Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology. Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).
- Singh, N., et al. Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).
- Ryll, T., et al. Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality. Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).
- Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).
- Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors. 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).
- Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting. The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).
- Dutra, B., et al. A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration. Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).
- Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. Acoustic perfusion devices. US patent. , (2017).
- Wu, X., et al. Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1. Science. 329 (5993), 856-861 (2010).
- Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures. Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).
- Wolf, M. K. F., et al. Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition. Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).
- Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media. Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).
- Emily, B., et al. Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling. BioProcess International. 8, 32-39 (2010).
